Способ получения факторов 1,2,3,4,5 тейхомицина @ и их солей Советский патент 1987 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/45 

1

Изобретение относится к биот€:хнологии, в частности к производству антибиотиков.

Целью изобретения является создание способа получения новых антибио- тиков - факторов 1,2,3,4,5 тейхомици на А и их солей.

Пример 1. Юг тейхомицина А , полученного путем культивирования штамма Actinoplanes teichomyce- ti,cus nov. sp. ATCC 31121, растворяют в 1 л 0,2%-ной смеси формиата аммония и ацетонитрила (9:1). Значение рН.полученного раствора с помощью

1н, раствора гидроокиси натрия до- водят до 7,5. Раствор пропускают через колонку, содержащую 500 г сила- нированного силикагеля 60 фирмы Мерк

Затем колонку злюируют с помошрью линейного градиента- 10-20% ацетонит- рила в 0,2%-ном растворе формиата аммония при общем обьеме 10 л.

Фракции (около 20 мл) собирают и исследуют с помощью ВТХ (тонкослойная хроматография под высоким давле- нием) : колонка: 5 мк Lorbax® ODS (фирмы Дюпон (DU Pont); подвижная фаза: линейный градиент 0-50%-ньй раствор Б в А в течение 40 мин.,раствор А: 25 мМ NaH,jP04/ацетонитрила (9:1), забуферованный до рН 6,0 посредством 0,1 н. NaOH; раствор Б; 25 мМ Nall PO /ацетонитрила (3:7), забуферованный до рН 6,0 посредством 0,1 н. NaOH); скорость потока

2мл/мин; детектор: УФ-фотометр при 254 нм, .

В табл. 1 указаны времена удерживания tg ДЛЯ факторов 1, 2, 3, 4 и 5 тейхомицина А в показательном пр цессе разделения с помощью БТХ с указанием в ней условнй проведения хроматографии, IТ а б л и ц а

0

0 5

0

5

0

5

Фракции со сходным профилем ВТХ собирают и органический растворитель упаривают под пониженным давлением. Оставшиеся водные растворы пропускают через колонку, содержащую 10 г спланированного силикагеля 60 фирмы Мерк. Колонку затем промывают дистиллированной водой в целях удаления формиата аммония и злюируют 50%-ным водньш ацетонитрилом. Элюат концентрируют до небольшого объема путем добавления бутанола для облегчения упаривания воды и осаждают его смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг фактора

1и 770 мг фактора 2 тейхомицина А в чистом виде.

Смесь факторов 3 и 2 тейхомицина А- (1:1) подвергают дальнейшей очистке с помощью БТХ на полупрепаративной колонке при следующих условиях: колонка: Whatman Partisil® ODS М 9 10/50 (содержащая октадецилси- лан); подвижная фаза: 0,-2%-ный фор- миат аммония в смеси и ацетонит- риЛа (7 6:24); скорость потока: 4,5 мл/мин; детектор: УФ-фотометр при 254 нм; загрузка: 20 мг.

Очистку проверяют исследованием каждой фрак.ции с помощью ВТХ.

Фракции, содержащие чистый фактор

2и 3 тейхомицина А., собирают, обессоливают и осаждают, как описано.

Выход:510 мг фактора 2 и 520 мг фактора 3.

Фракции, содержащие факторы 4 и 5 в соотношении 1:1 (около 500 мг), полученные из первой колонки, объединяют с другой смесью фракций, содержащей факторы 4 и 5 (около 490 мг) и полученной в результате проведения второго паргшлельного процесса разделения путем полупрепаративной ВТХ, разделяют при условиях, описанных для очистки фактора 3 тейхомицина AJ, с получением 350 мг фактора 4 и 300 мг фактора 5. I

Фактор I тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок, который при температуре около 220 С начинает темнеть и при 255 С полностью разлагается. Химико-физическая характеристика его следующая:

а) легко растворим в воде при значении рН Bbmie 7,0 или ниже 2,-а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, мапорастворим в метилцеллозольве и глицерине, сшаборастворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хло313

реформе, бензоле, п-гексане, ацето- нитриле, диэтиповом эфире, ацетоне, .этилацетате, тетрахлорметане;

б)имеет спектр УФ-поглощения со. следующими максимумами поглощения: в 0,1 н, хлористоводородной кислоте

™ I IM фосфатном буфере при значении рН 7,4 278 им (,0), в 0,1 н. гидроокиси натрия Л ,(. 297 нм ( 72 ,1)

в)имеет спектр ИК-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (ну- йоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (ну- йоль), 1375 (нуйоль) 1305, 1230, 1180 1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (нуйоль);

г)элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмос- фере (% ,5), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,70,- Н 4,90,

N 6,65, С1 3,80, О (вычислен как остаток до 100%) 27,95;

д)время удерживания (t) составляет 21,2 мин в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lorbax® CDS и элюи- рованием с помощью линейного гради- ента, О - 50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин со скоростью потока 2 МП/мин (внутренний эталон: 3,5-диокситолуол при t

8,84 .мин);

е)в ДМСО-d, с добавлением нескольких капель с концентрацией 25 мг/0,5 мл ТМС в качестве внут- реьшего эталона: ,00 ч, на млн получают следующие группы сигналов в 5ШР-спектре 270 МГц Н: 0,8-1,5(м) 1,7-2,3 (м.); 2,7-4,0 (м.); 4,04,7 (м.); 4,8-5,8 (м.); 6,2-8,1 (м.)

ж)имеет кислотную функцию, способную образовать соли;

з)имеет солеобразующую основную функцию;

и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией с использованием скорой атомной бомбардировки (САБ)в качестве источника ионов, составляет около 1875.

Фактор 2 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок, который после нагревания до 210°С начинает темнеть и разлагается полностью при 250 С. Его характеристика следующая:

0.

5 .

0

5

,

5

0

704

а)легко растворим в воде при значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицег рине, слабо растворим в метаноле-и этаноле и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонит- риле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане,

б)имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения:

в 0,1 н. хлористоводородной кислоте Л „„,, 278 нм (Е,),

в фосфатном буфере при значении рН 7,4, ,с 278 нм (Е|° 49,0);

в 0,1 н. гидроокиси натрия д 297 нм (К,,0);

в)имеет спектр Ж-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2860 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (нуйоль);

г)элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 140°С в инертной атмосфере (% ,8), показывает следую- щий приблизительный средний процент- ньй состав, %: С 56,15; Н 5,15;

N 6,30; С1 3,90, О (вычислен как остаток до 100%) 28,50;

д)время удерживания (t) в случае анализа путем обратнофазной ВТХ

с использованием колонки 5 мк LorСйЬах CDS и элюированием с помощью

линейного градиента 0-50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 22,6 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон: 3,5-диокситолуол, tg 8,84 мин);

е)в ДМСО-d с добавлением нескольких капель DjO с концентрацией 25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внутреннего эталона: 0,00 ч. на млн получают следующие группы сигналов

в ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5(м); 1,8-2,2 (м.); 2,7-4,5 (м.); 4,6- 5,7 (м.); 6,2-8,1 (м.);

ж)имеет кислотную функцию, способную образовывать соли;

з)имеет солеобразующую основную функцию;

и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1877. j

Фактор 3 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок, который после нагревания до 205 С

5

начинает разлагаться с полным разложением при 250°С. Он имеет следующую характеристику:

а)легко растворим в воде нри значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также .в ДМФ, ДМСО и нрониленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине, слабо растворим в метаноле и этаноле, и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гек,сане, аце- тонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане.

б)имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения:

в 0,1 н, хлористоводородной ки слоте ,, 278 нм (Е 49 ,2) , в фосфатном буфере при значении рН 7,4

h

макс

278 нм ( 50,8), в 0,1 н.

. - . 0{

гидроокиси натрия А махе 297 нм (Е 72,7);

в)имеет спектр ИК-поглощения в нзшоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2850 (ну- йоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (ну- йоль), 1375 (нуйоль), 1300,.1230, 1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970,

890, 845, 820, 800, 720 (нуйоль);

г)элементарный анализ пробы,предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмосфере (,0), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,26; Н 5,20; N 6,69;

С1 3,95, О (вычислен как остаток до 100%) 27,90;

д)время удерживания (t) :в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lor- bax®ODS и -элюированием с помощью хш нейного градиента О - 50%-ного раст- вора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 23,3 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3,5-диокситолуол при t. 8,84 мин);

е)в ДМСО-dg с добавлением не- скольких капель Dj,0 с концентрацией

25 мг/0,5 М.П (ТМС в качестве внутреннего эталона ,00 ч. на млн) получают следующие группы сигналов в ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5 (м.); 1,8-2,0 (м.); 2,7-4,5- (мЛ;

4,6-5,7 (м.); 6,2-8,0 (м.); I

ж)имеет кислотную функцию, способную образовывать соли;

з)имеет солеобразующую основную функцию;

и) молекулярная масса, определеная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1877.

70 6

Фактор 4 тейхомицина A,j представляет собой белый аморфный порошок, который после нагревания до температуры около 210°С начинает темнеть и разлагается полностью при 250 с, Он имеет следующую характеристику:

а)легко растворим в воде при значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицеринеJ слабо растворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, аце- тонитриле,диэтиловом эфире, ацетоне этилацетате, тетрахлорметане;

б)имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимз мами поглощения:

в 0,1 н. хлористоводородной ки- слоте Л.акс 278 нм (,5),

в фосфатном буфере при значении рН 7,4 „,с 278 нм (,5),

в 0,1 н, гидроокиси натрия Адлакс 297 нм (Е;; ; 75,5);

в)имеет спектр ИК-по глощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль); 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1230,. .1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890,

840, 815, 720 (нуйоль);

г)элементарный анализ пробы. Предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмосфере (% ,j8)5 показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,50; Н 5510;

N 6,50; С1 3,80; О ( вычислен как остаток до 100%) 28,10;

д)время удерживания (t) в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lor- bax CDS и элюирования с помощью линейного градиента О - 50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 ми составляет 25,8 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3.5-диокси-толуол, t,, -8,84 мин);

е)имеет кислотную функцию, способную к солеобразованию;

ж)имеет солеобразующую основную функцию;

з)молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией GAB,.составляет около 1891,

Фактор 5 тейхомицина А. представляет собой белый аморфный порошок,- который после нагревания до 210 С начинает темнеть и полностью разлага71

ется при . Он имеет следующую характеристику:

а)легко растворим в воде при значении рН вьше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленглико- ле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине, слаборастворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хлороформе, -бензоле, п-гексане, аце- тонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате и тетрахлорметане;

б)имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения:

в 0,1 н. хлористоводородной ки- сл°те „ 278 нм (,6),

в . фоссЬатном буфере при значении рН 7,4 Хмакс 278 нм (,8),

в 0,1 н. гидроокиси натрия д,д 297 нм (,8);

в)имеет спектр Ж-поглощения в- нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (ну- йолъ), 1645, 1590, 1510, 1460 (ну- йоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1230, 1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (нуйоль);

г)элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 140 °С в инертной атмосфере (% ,l), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,60-, Н 5,05,

N 6,63, С1 3,85, О (вычислен как остаток до 100%) 27,87;

д)время удерживания (t) в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lor- bax® ODS и элюирования с помощью линейного градиента 0-50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 26,4 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон: 3,5-диокситолуол при t 8,84 мин);

е)имеет кислотную функцию, способную образовывать соли;

ж)имеет солеобразующую основную функцию;

з) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1891 .

Каждый из факторов 1-5 тейхоми- цина А2 содержит кислотный остаток, способный образовывать соли.

П р и м е р 2. Вьщеление факторов 1-5 тейхомицина А, с применением хроматографической колонки из диэтиламиноэтилсефацеля.

500 мл DEAE-Sephacel (Farmacia Fine Chemicaks, Швеция) вливают в

08

колонку диаметром 4 см и затем уравновешивают с применением 50 ммоль аммонийхлоридного буфера при рН 9,0. На этой колонке хроматографируют

1 г комплекса тейхомицина А, растворенного в 50 мл того же буфера, элюируя элюир тощей смесью, состоящей из того же буфера, с линейным градиентом 0-1 моль хлористого натрия в общем количестве 5 л. Затем собирают около 20 мл фракций, обрабатывают жидкостной хроматографией под высоким давлением, отдельные фракции, содержащие антибиотики,

соединяют и обрабатывают в целях выделения веществ - антибиотиков.

Ниже приведены наивысшие концентрации отдельных факторов, мл. элю- ированного объема:

Тейхомициновый Наивысшая концент25

30

П р и м е р 3. Получение солей факторов 1-5.

К солям со щелочными и щелочноземельными металлами относятся соли натрия, калия, лития, кальция и магния . Аммониевые соли включают аммониевые соли и соли первичного, вторичного или третичного алкиламмония С,4 и оксиалкиламмония С

Соли со щелочными и Ш1елочноземель- ными металлами получают известными способами. Так, факторы тейхомицина

А в свободном кислотном виде растворяют в пропиленгликоле с последующим постепенным добавлением к полученному раствору стехиометрического количества выбранного минерального

основания, осаждением и фильтрацией. Указанные соли можно также получить практически в безводном виде посредством лиофилизации. В этом случае водные растворы соли, полученные

в результате образования солей из свободных кислот с помощью карбонатов или гидроокисей щелочных или щелочноземельных металлов в количествах, обеспечивающих значение рН в

9131

ределах 7-8, отфильтровывают от неастворимых веществ и лиофилизуют,

Органические аммониевые соли по- учают добавлением амина к раствору акторов 1-5 тейхомицина А, в свободном кислотном виде, например, в про- пиленгликоле с последующим упариваием растворителя и избыточного аминного реагента или взаимодействием двух реагентов в минимальном коичестве воды с последующим осаждеием полученных солей путем добавления нерастворителя.

.Факторы 1-5 тейхомицина А содерат также гидроксидный остаток, за счет.которого также могут быть образованы соли путем - взаимодействия отдельных факторов Ё чистом виде с сильной кислотой, предпочтительно инеральной.

ПримерД. 0,5г фактора 1, 2,3,4 или 5 тейхомицина А в виде свободной кислоты растворяют в воде (око лО 50 мл), рН 7,5. Доводят раствор до рН 6,5 10%-ной хлористоводородной кислотой и прибавляют стехио- етрическое количество (или Си8С)), растворенное в минимальном количестве воды.

Смесь перемешивают при комнатной температуре для облегчения образовс1- иия осадковJ которые собирают фильтрованием, дважды промывают ацетоном (около 600 мл) и сушат всю ночь в вакууме при комнатной температуре.

Получают 0,43 г (85-88%) цинковой или медной соли фактора 1,2,354 или 5 тейхомицина А.

Прим -ер 5. 0,5 г фактора I , 2,3,4-ИЛИ 5 тейхомицина А в виде свободной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила..Прибавляют воду (около 50 мл), рН 7,5. Доводят раствор примерно до рН 6,5 10%-ной xлopиcтoвoдopo з,нoй кислотой. Прибавляют стехиометрическое количество BaClj (или CaCl или MgCl), растворенное в минимальном количестве воды.

Смесь перемешивают при комнатной температуре. Полученную соль удаляют прибавлением избытка ацетона (около 500 мл) и фильтрованием полученных осадков, которые дважды промывают ацетоном (около 600 мл) и подвергают продолжающейся всь ночь сушке в вакууме при комнатной температуре,

Ползгчают 0,40 г. (84-87%) бариевой (кальциевой или магниевой) аоли.

7010

Примерб. 0,5г фактора 1,2,

3.4или 5 тейхомицина А в виде свободной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила. Потом прибавляют воду (около 50 мл), рН 7,5, Доводят раствор примерно до рН

6.510%-ной хлористоводородной кислотой. Прибавляют стехиометрическое количество основания (в виде концентрированного во.дного раствора для

КОН или или в виде чистого раствора в случае NK,jCK,, NH ,

5

N(C,,1,),

,,,, Ш(., N(CH,), ,

0

5

0

5

0

5

0

5

NH(CH,).

и т.д.).

Смесь перемешивают при комнатной температуре. Полученную соль удаляют прибавлением избытка ацетона (около 500 мл) и фильтрованием полученных осадков, которые дважды промывают ацетоном (около 600 мл) и сушат в течение ночи в вакууме при комнатной температуре.

Получают 0,45 г (84-90%) соответ- ствующей соли.

Приме р 7, Получение натриевой соли фактора 2 тейхомицина А.

Водный раствор фактора 2 тейхоми- - цина А (150 мг, 15 мл) путем до- -бавления по каплям 0,1 н. раствора NaOH доводят-до рН 8,0. Полученньш раствор фильтруют и переносят в камеру системы сублимационной сушки и замораживают. По завершении замораживания камеру эвакуируют до давления 0,1 Торр и лед сублимируют доведением нагревательной плиты до О С, продолжая этот процесс до достижения почти сухого состояния продукта (до влагосодержания около 1% ), Титрование раствора полученной таким образом натри€;вой соли фактора 2 тей- хокицина А в 25 мл метилцеллозольва/ (3:1) с 0,1 н. раствором НС1 показывает присутствие двух титруемых функций, отличающихся следующими значениями рН: 7,03 и 4,78.

По указанной методике получают соответствующие натриевые соли факторов 1, 3, 4 и 5 тейхомицина А. Оп- ред«шение количества натрия в конечных солях подтверждает образование мононатриевой соли.

Бактериостатическую активность факторов 1-5 тейхомицина А in vitro против грамположительных бактерий определяют на клинических изолятах бактерий Staphylococcus и Streptococcus с использованием метода двукратного разведения с помощ ью микро- ,

П1318170 . 12

титровальной системы, причем для на- трацией считается самая низкая кон- званных групп бактерий используют центрация, при которой отсутствует .бульоны Пенассея и Тодда-Хьювитта видимый рост после инкубации в те- фирмы Дифко. Выращенные в течение чение 18-24 ч при 37 С. ночи бульонные культуры разбавляют

до содержания 10 млн кл./мл. Ми- Полученные результаты приведены нимальной бактериостатической концен- в табл. 2.

Таблица2.

Бакте зиостатическое действие in vitro факторов 1-5 тейхомицина А

Бактериостатическую активность агаровых пластинок, засеянных сус- отдельных факторов определяют ме- зо пензией испытуемого микроорганизма, тодом повторного разведения с помо- Пластинки инкубируют при 37 С в те- щью агаровых пластинок с использованием бактерий штамма S. aureus

чение 18 ч и измеряют диаметры зон ингибирования.

35

АТСС 538 в качестве испытуемого микроба и смеси тейхомицина А в качестве эталона. При этом одинаковые количества отдельных факторов 1-5 тейхомицина А и смеси последнего в качестве эталона растворяют в ДМФ при концентрации 2000 мкг/мл. Полу- Q ченные растворы подвергают дальнейшему разведению с использованием 0,067 моль фосфатного буфера для установления рН 7,4 и добавлением

Ниже приведены результаты испытания:

Фактор тейхомицина А

1841 и/мг

21086 и/мг

31131 и/мг

41066 и/мг

5954 и/мг Смесь тейхомицина Aj 1000 и/мг Действие факторов 2, 3, 4 и 5

1%-ной бычьей сыворотки в целях обес- тейхомицина А,, испытывали в экспери- печения следуюпщх концентраций: менте с мьппами, зараженными S. pneu- 2,5; 5J 10 и 20 мкг/мл. Диски филь- moniae и S. pyogenes. Для сравнения тровальной бумаги пропитывают раст- брали смесь тейхомицина Aj. ворами пробы и помещают на опреде- Полученные результаты указанных

ленных расстояниях -на поверхность

агаровых пластинок, засеянных сус- пензией испытуемого микроорганизма, Пластинки инкубируют при 37 С в те-

чение 18 ч и измеряют диаметры зон ингибирования.

Ниже приведены результаты испытания:

Фактор тейхомицина А

1841 и/мг

21086 и/мг

31131 и/мг

41066 и/мг

5954 и/мг Смесь тейхомицина Aj 1000 и/мг Действие факторов 2, 3, 4 и 5

50

опытов приведены в табл. 3.

Таблица 3 Бактериостатическое действие на мьшгах

ЭД,,, (мг-кг/сут) п/к

S. pneumoniae S. pyogenes )

0,28(0,22-0 ,34)0,15(0,13-0,18)

0,27(0,23-0,32)0,13(0,11-0,16)

0,12(0,98-0,14)0,098(0,073-0,11)

0,13(0,10-0, 15)0,10(0,098-0,13)

Смесь

тейхомицина А, 0,35(0,28-0,44) 0,8(-)

Приблизительная острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно) для факторов 1-5 тейхомицина А, приведе- на в табл. 4.

Таблица 4

Острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно)

Примерная ЛД мг/кг

о

1500.С2000

1500с2000

1000 :1500

500 1000

Из табл. 4 следует,, что факторы 1-5 тейхомицина А пригодны для применения в качестве действующего на- чала в противомикробных препаратах в медицине и ветеринарии для предупреждения и лечения инфекционных заболеваний, вызванных патогенными бактериями, чувствительными к названным соединениям.-Предлагаемые соединения можно использовать для лечения инфекционных заболеваний как таковые, т.е. как отдельные факторы или ввиду сходства их характеристик активности и в виде смеси двух или: более факторов в любом соотношении.

Соединения вводит орально, мест- но или парентерально, предпочтительно парентерально. В зависимости от способа применения соединения его

готовят в различных лекарственных формах. Для орального введения препараты могут представлять собой кап5 сулы, таблетки, жидкие растворы или суспензии. Как известно, капсулы и таблетки кроме действующего начала могут содержать еще обычные инертные наполнители (носители), такие как

0 разбавители, например лактоза, фосфат кальция, сорбит и др., смазки, например стеарат магния, тальк, по- лиэтиленгликоль, связующие, например поливинилпирролидон, желатин,

сорбит, трагант, камедь, ароматизи- руюрще вещества, средства, способствующие разложению препарата и смачиватели. Жидкие препараты обычно в виде водных или масляных растворов или суспензий могут содержать,обычные добавки, например вещества, содей- ствуюш;ие взвешиванию. Для местного применения соединения можноприготовить в виде препаратов для введения

5 через слизистые оболочки носа и горла или бронхиальные ткани, обычно в виде жидких аэрозолей или средств для ингаляции,, лепешек или тинктур, наносимых на поверхность горла. Для лечения глаз или ущей можно использовать жидкие или полужидкие препараты. Препараты для местного применения можно приготовить на гидрофобной или гидрофильной основе в виде мазей, кремов, лосьонов, тинктур или порошков , впрыскиваемые составы - в виде суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных носителей, содержащих вещества, способствующие

0

0

5

151

взвешиванию, стабилизаторы и/или дис дергаторы. Кроме того, действующее .начало может быть приготовлено в виде порошка в целях его воспроизводства во время поставки с пригодным но- сителем, например, стерильной водой.

Количество применяемого действующего начала зависит от различных факторов, например роста и состояния здоровья пациента (животного), способа и частоты применения препарата и причины заболевания. Как правило, факторы 1-5 тейхомицина А являются зффективньши при суточной дозировке в пределах около О,1-20 мг действующего начала на кг веса, причем эта доза может быть разделена на два приема в день. Целесообразны составы, приготовленные в виде дозировочных единиц с содержанием около .50- 250 мг действующего начала на единицу.

. Примеры фармацевтических составов: раствор для парентерального введения из 100 мг натриевой соли фактора 2 тейхомицина А, растворенной в 2 мл стерильной воды дпя впрыскивания; раствор для парентерального введения из 250 мг натриевой соли фактора 3 тейхомицина А, растворенной в 3 МП стерильной воды для впрыскивания; мазь для местного нанесения из 200 мг фактора 2 тейхомицина А, 600 мг полиэтиленгликОЛЯ 4000 U.S.Р. 1,2 г полиэтиленгликоля 400 U.S.Р.

Наряду с применением в виде лекарств предлагаемые соединения можно использовать и как промоторы роста животных. С этой цели одно или несколько соединений вводят орально

Редактор К.Волощук Заказ 2441/58

Составитель Г.Смирнова Техред М.Моргентал

Корректор

Тираж 499Подписное

ВНИИШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

70

с кормом

16

При этом выбирается такая концентрация соединений, которая является эффективной для промотирова- ния роста животных. При этом сначала готовят смесь части корма с эффективным количеством действующих соединений, которую затем добавляют к полной порции корма, или с кормом смешивают промежуточный концентрат, содержащий действующее начало.

Формула изобретения

1.Способ получения факторов 1,2, 3,4,5 тейхомицина А и их солей, заключающийся в том, что тейхомицин, полученный путем культивирования штамма Actonoplanes teichomyceticus nov. sp. АТСС 31121, переводят в раствор, подвергают его обратнофазной хроматографии на колонке, содержащей силанированньй силикагель, элюи- руют с помощью линейного градиента от 10 до 20% ацетонитрила в 0,2%-ном растворе аммонийформиата, полученные фракции сходного профиля объединяют, концентрируют, осаждают целевые продукты и/или переводят в соли.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что, с целью доЬол- нительного разделения факторов 2, 3, 4, 5 тейхомицина А, смесь факторов 2, 3, 4 и 5 подвергают обратнофазной хроматографии на колонке, содержащей октадецилсилан, элюируют смесью ацетонитрила и 0,2%-ного водного аммонийформиата в соотношении 24:76 с последующим обессоливанием фракций.

и осаждением целевых продуктов.

Корректор И.Муска

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотиков - факторов 1,2,3,4, 5 тейхомицина А. Цель изобретения - разработка способа разделения тейхомицина AJ, на факторы 1,2,3,4,5 и получение их солей, сущность способа сводится к тому, что тейхомицин Aj, полученный при культивировании Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121, растворяют, подвергают обратнофазной хроматогра фии на колонке, заполненной спланированным силикагелем, Элюцию проводят с помощью линейного градиента от 10 до 20% ацетонитрила в 0,2%-ом растворе ам- монийформиата. Соединяют фракции сходного профиля, концентрируют с помощью бутанола и осаждают смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг фактора 1 и 770 мг фактора 2 в чистом виде. Далее смесь факторов 3 и 2 и факторов 4 и 5 пропускают через колонку, заполненную . октадецилсиланом, элюируют смесью водного 0,2%-го раствора формиата аммония и ацетонитрила в соотношении 76:24. Фракции отбирают, обессоливают и осаждают аналогично получению фактора 1 и 2. В результате получают дополнительно 510 мг фактора 2, -а также 520 мг фактора 3, 350 мг фактора 4 и 300 мг фактора 5. Полученные антибиотики обладают активностью в отношении грамположительных микроорганизмов. 4 табл. i СО со х 04