Штамм бактерий РLаNовISроRа RoSea АТСС 53773 - продуцент фактора А антибиотика GE 2270, способ получения фактора А антибиотика GE 2270, фактор А антибиотика GE 2270 Советский патент 1993 года по МПК C12P1/00 

количеств противомикробных веществ. Среда, используемая для предварительного культивирования, может быть той же самой, что и для дальнейших ферментации, но могут быть также применены другие среды. Штамм, продуцирующий антибиотик GE 2270, может быть выращен при температурах между 20 и 40°С, предпочтительно между 24 и 35°С.

Во время ферментации получение антибиотика контролируют с помощью испытательного бульона или образцов экстракта мицелия для противомикробной активности, например, путем биологических проб или TLC или HPLC методик.

Организмы, чувствительные к антибиотику GE 2270, такие как Bacillus subtllls и S.aureus используют в качестве тестовых организмов. Биологическую пробу осуществляют с помощью метода диффузии в агаре на агаровых пластинах. Максимум получения противомикробной активности имеет место между вторым и пятым днем ферментации..

Антибиотик GE 2270 получают культивированием штамма Planoblspora rosea АТСС 53773, продуцирующего антибиотик GE 2270, и находят, в основном, в мицелии.

Термин антибиотик GE 2270 относится к комплексу антибиотика GE 2270, который выделяют в конце процесса ферментации (см. пример 2), также как и к антибиотику GE 2270 фактор А, который является его главным компонентом. Антибиотик активен в качестве агента, стимулирующего рост домашних животных и птиц.

Морфологические характеристики Pianobispora rosea ATCC 53773.

Pianobispora rosea ATCC 53773 растет хорошо на большинстве стандартных сред. Вегетативный мицелий образует длинные и нерегулярно разветвленные филамеиты (0,5-1,0 мкм), пронизывающие агар и образующие компактное новообразование на его поверхности. Мицелий остается нефраг- ментированным, независимо от того, происходит ли рост в жидкой и/1и твердой среде. Его цвет колеблется от светлокораллового до красно-кораллового на большинстве испытуемых сред. Воздушный мицелий образован из длинных волнистых и тонких гифов с небольшими боковыми разветвлениями и растет на воздухе, в основном, параллельно поверхности агара. Воздушный мицелий, когда он присутствует, имеет бело-красный цвет. Сорангии образуются по одиночке или группами вдоль гифов воздушного мицелия и имеют длину около 6,6-8;0 микрон и ширину 1,0-1,2 микрона. Они прии

соединяются к гифу коротким спорангиеиос- цем (1,0-2,0 мкм в длину). Продольная пара веретенообразных прямых спор (от 3,0- 3,5x1.0 до 1.2 мкм) образуется в каждом спо- рангии, В спорангиях споры отделены поперечной-перегородкой, После отделения от оболочки спорангии споры становятся подвижными посредством perltrichous flagella.

Культуральные характеристики Pianobispora rosea АТСС 53733.

Для изучения культургльных характеристик Pianobispora rosea ATCC 53733 культивируют на различных стандартных средах.

При необходимости делают цветовое определение.

Культуральные и физиологические характеристики и использование источников углерода представлены в таблицах I,II,III.

В табл. 1 даны значения, полученные после двух недель инкубирования при 28°С.

Для этого теста применяют среду № 8 и результаты оценивают после двухнедельного инкубирования при 28-30°С.

Чувствительность к температуре. Оптимум температуры роста колеблется от 28°С до 37°С.

Не наблюдают роста гщи 15°С и 50°С. умеренный рост при 20°С.

Хемотаксономические характеристики. Анализ оболочки клетки:

Анализ аминокислот, присутствующих в . оболочке клетки, выполняют по методу, описанному Becker и др. (Быстрая дифференциация между nocardia и Streptomyces путем бумажной хроматографии гидролизо- ванной полной клетки, Spll. Microbiol 12, 421-423, 1964).

Анализ гидролизованной полной клетки показывает присутствие мезо-диаминопи- мелиновой кислоты. .

При анализе препарата чистой оболочки клетки глицина не обнаружено.

l iЈPJHl Jl0.0Ј0JiQ§IP4.H.9Io... Анализ содержания сахара в гидролизованной полной клетке проводят по методу Lechevalier M.P. (Идентификация клинически важных аэробных актиномицетов I.Lab.Cliri.Med. 71, 934-944, 1968), используя целлюлозные листы для тонкослойной хроматографии, как описано Staneck S.L and G.D. Roberts (Упрощенный подход к идентификации аэробных актиномицетов путем тонкослойной хроматографии, Appi. Microbiol. 28, 226-231, 1974) со содержащей системой растворителей: этилацетат-пири- дин-вода (100:35:25 об./об.).

Полученные результаты показывают присутствие мадурозы (3-0-метил-О-галак- тоза) и отсутствие арабинозы и галактозы.

35

40

45

50

55

Идентификация штамма Planobispora rosea ATCC 53733.

Этот штамм относят к роду Planobispora rosea и классифицируют как Planobispora rosQa вследствие следующих морфологических и химических характеристик:

а) Присутствие мезо- диаминопимели- новой кислоты и отсутствие глицина в оболочке клетки (оболочка клетки хемотип III)

в) присутствие мадурозы в гидролизате полной клетки (картина В полного клеточного сахара)

. с) образование на воздушном мицелии длинной и цилиндрической спорангии, содержащей пару подвижных спор

d) красный цвет вегетативного мицелия

Морфологические характеристики Planobispora rosea ATCC 53733, сообщенные оыше, не существенно отличаются от морфологических характеристик штамма Plariobispora rosea, который описан I.E. Thilman с сотр. о Актиномецетали The Lena Intern. Symp. on Tascon., September, 1968, ed, A. Prauser. Lena.

Он депонирован American Type Culture Collection и зарегистрирован под номером 23866. Для этого штамма не описано антибактериальной продукции.

Как упомянуто оыше.. антибиотик GE 2270 находят обычно в мицелии продуцирующего штамма, хотя незначительное количество вещества находят также в ферментационном бульоне.

Предпочтительная методика для выделения антимикробного вещества изобретения из мицелия включает экстрагирование фильтрованного или центрифугированного мицелия органическим растворителем, смешивающимся с водой, концентрирование экстрактов и выделение сырого антимикробного вещества осаждением, необязательно добавлением осаждающего растворителя, экстракцией водного остатка органическим растворителем, не смешива- ющимсясв.одой;или адсорбционной хрома- тографией с последующим элюированием желаемого продукта из адсорбционной матрицы.

Предпочтительная методика для выделения антимикробного вещества данного изобретения из ферментационного бульона . включает экстракцию органическим растворителем, несмешивающимся с водой, с последующимосаждением из концентрированных экстрактов возможно добавлением осаждающего агента или дальнейшей экстракцией водного остатка их с органическим растворителем, несмешивающимся с водой. Напротив, ферментационный бульон может контактировать с

адсорбционной матрицей с последующим элюированием полярной элюирующей смесью. Это хроматографическая методика может также приняться к концентрирован- 5 ному экстракту, полученному из ферментационного бульона вместо самого бульона.

Примерами органических растворителей, смешивающихся с водой, которые могут быть использованы при экстракции

0 антимикробного вещества изобретения из мицелиевой массы, являются: низшие алка- нолы, например (Ci-Сз) алканолы, такие как метанол, этанол и пропанол, фенил (Ci-Сз) алканолы,такие как бензиновый спирт, ни5 зшие кетоны, например, (Сз-С-0 кетоны, такие как ацетон и этилметилметон, циклические эфиры, такие какдиоксан и тет- рагидрофуран, гликоли и их продукты частичной эгерифи кации, как

0 этиленгликоль, пропиленгликоль и этиленг- ликоль монометиловый эфир, низшие амиды, такие как диметилформамид и диэтилформамид.

Примерами органических растворите5 лей, месмешйвающихся с водой, которые могут быть использованы в экстракции антимикробного вещества изобретения из ферментационного бульона являются обычные углеводородные растворители, которые

0 могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такими как гексан или циклогексан, галогенированные углеводороды, такие как хлороформ, четыреххлори- стый углерод, дихлорэтан, фторбромзтан,

5 дибромэтан,трихлопропан,хлортрифторок- тан, и тому подобное: ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол, ксилол, и тому подобное; эфиры из по крайней мере четырех атомов углерода, такие

0 как этилацетат, пропилацетат, этилбутират и тому подобное} алканолы из, по крайней мере; четырех атомов углерода, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, такие как бутанол, 15 пентанол, 2-пентанол, 3-пемтанол, 1-гекса- .. нол,2-гексанол, 3-гексанол, 3,3-диметил-1-бутанол, 4-метил-1 -пентанол. З-метил-1-пентанол, 2,2-диметил-З- пснтанол, 2,4-диметил-З -пентанол,

0 4,4-диметил-2-пентанол, 5-метил-2-гексанол, 1-гептанол, :2-гептанол, 5-метил-1гексанол,2-этил-1-гексанол,

2-метил-З-гексанол, 1-октанол, 2-октанол,

циклопентанол, 2-циклопентилэтанол, 35 циклопентил-1-пропанол, циклогексанол, циклогептаяол, циклооктанол, 2,3-диметил- циклогексанол, 4-этил-циклогексанол, цик- лооктилметанол, 6-метил-5-гептен-2-ол, 1-нонанол, 2-конанол, 1-деканол, 2-деканол и 3-деканол, линейные и разветвленные ал«сильные зфиры и смеси их, такие как петро- лейный эфир, этиловый эфир, пропиловый эфир, бутилбвый эфир и т.д.; и смеси или функциональные производные их.

Как известно в данной области техники, фазовое разделение может быть улучшено путем высаливания.

Когда применяют экстракцию, выделяют водную фазу, содержащую значительное количество органического растворителя, при этом может быть удобно азеотропно дистиллировать воду из нее, Обычно это требует добавления растворителя, способного образовывать минимальные азеотроп- ные смеси с водой с последующим добавлением осаждающего агента, чтобы осадить желаемый продукт, если необходимо. Характерными образцами органических растворителей, способных образовывать минимальные азеотропные смеси, являются н-бутанол, бензол, толуол, бутиловый эфир, четыреххлористый углерод, хлороформ, циклогексан, 2,5-диметил-фуран, гек- сан и м-ксилол, предпочтительным растворителем является н-бутанол.

Примерами осаждающих агентов являются петролейный эфир, низшие алкильные эфиры. такие как этиловый эфир, пропиловый эфир и бутиловый эфир, и низшие алкильные кетоны, такие как ацетон,

Примерами хроматографических систем, которые могут быть обычно использованы при выделении антимикробного вещества изобретения, являются полистирол или смешанные смолы полистирол-ди- винилбензол, такие как Amberlite ХАД 2 или ХАД 4 (Rohm and Haas), S 112 (Dow Chemistry Co.) и Diaion HP 20 (Mitsubishi); акриловые смолы, такие как ХАД 7 или ХАД 8 (Rohm and Haas); полиамиды, такие как поликапролак- тамы, найлоны и сшитые поливинилпирро- лидоны, обычно имеющие объем пор (мл/г) в пределах между 1 и 5, площадь поверхности (м /г) в пределах между 1 и 100, кажущаяся плотность (г/мл) в пределах между 0,15 и 0,50, средний диаметр пор (ангстремы) в пределах между 300 и 300Qи распределение частиц по размеру, где по крайней мере 40 процентов частиц по размеру меньше, чем 300 микрометров, такие как Полиамид-СС 6, Полиамид - SC 6, Полиамид-СС 6,6. Полиамид-СС 6АС и Полиамид-SC 6АС (Macherey Nagel and Co., West Germany), поливинил- пирролидоновая смола PVP-CL (Aldrich Chemic. GmbH and Co., KS - West Germany), полиамидная смола РА 400) M.WocIm AG, West Germany); и углерод.

В случае полистирольной или акриловой смолы предпочтительным элюентом я в- ляется с месь полярных растворителей.

растворителей смешивающихся с водой, таких как сообщено выше; в случае полиамидной смолы элюентом является предпочтительно водная смесь смешиваю- щегося с водой растворители, такого как растворитель, упомянутый выше, и то время как для углерода предпочтительным элюентом является низший кетон, такой как ацетон или низший спирт, такой как метанол. Дальнейшая очистка неочищенного образца антибиотика GE 2270 может быть выполнена по любой их известных методик, но предпочтительно проводить посредством хроматографических методик. Также удобно может быть применена так называемая стерическая эксклюзивная хроматографическая методика с хорошими результатами по очистке, В частности, сшитые декстраны с контролируемым размером пор, в которых большинство гидроксильных групп алкилировано, например, Сефадекс 1H20-(Pharmacia Fine Chemicats, Ab), обычно применяют в этой технике.

Как обычно в этой области техники, пол- учение, также как стадии выделения и очистки, могут контролироваться целым рядом аналитических методик, включая биологические пробы, такие как пробы на бумажном диске или агаровая диффузия, на чувстви- тельные микроорганизмы или методики тонкослойной хроматографии (TLC) или HPCI, которые могут включать ультрафильтрацию или стадию микробного задержания.

Предпочтительная методика HPLC представлена обращенно-фазовой HPLC, с . использованием колонки с пористым и сферическими частицами силинизированного силикагеля, например, силикагель, функци- онализированн.ый С-18 алкильными группа- ми, имеющий одинаковый диаметр (такой как 5 микрометров Ultrasphere ODS Altex Beckman Co.) пред-колонка которой является силикагелем, функцмонализированным С-18 алкильными группами (такой как RP 18 Brownlee Labs) и элюент которой является линейной градиентной смесью полярного смешивающегося с водой растворителя, таким, как один из растворителей, описанных выше, в водном буферном растворе. Пред- почтительно этот раствор доводят до р) 5- 7. Наиболее предпочтительный элюент представляет собой линейный градиент от 45 до 70% элюентаАвэлюентеВ, в котором элюент В является смесью ацетонитрил- 5 водный буфер, рН 5-7,10:90 и элюент А является смесью ацетонитрил/водный буфер, рН 5-7. 70:30.

Физико-химические характеристики антибиотика GE 2270 фактор А

а) Ультрафиолетовый спектр (УФ) поглощения, который представляет на рисунке 1 с сопутствующими пояснениями, демонстрирует следующие максимумы поглощения:

Е 1 % Лямбда

1см макс (нм) 0.1MHCI- 245 (плечо)

310 0.1МКОН- 245 (плечо)

313 Фосфатный буфер - 245 (плечо) рН7,4 314 Метанол 244 (плечо) 265 З Ю

б) инфракрасный спектр (ИК) поглощения в нуйоловой пасте, который представлен на рисунке 2 с сопутствующими пояснениями, демонстрирует следующие максимумы поглощения (см ): 3700-3060, 3060-2660 (нуйол); 1650; 1590-1490; 1490- 1420(нуйол); 1375 (нуйол); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840; 810; 750; 720 (нуйол); 700.

Главные функциональные полосы ИК поглощения этого спектра могут быть прописаны так:

V, (см )Отнесение 3600-3100 vNH. vOH 1650 - амид l() 1545 гетероциклическ

и

1525, 1495амид II (i- NH . 1250, 1205 ароматическая 5СН 870 гетероциклическая

YCH 745, 700ароматическая YCH

в) 1Н-ЯМР спектр, который представлен на рисунке 3, демонстрирует следующие группы сигналов (в ппм) при 500 мгц, запи- сайные в ДМСО-de (гексадейтеродиметил- сульфоксид), используя ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм); число протонов для каждого сигнала сообщено в круглых скобках:

9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1). 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96(2); 6,02(1); 5,30-5,18(3); 5,01(1); 4,97(2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4.26 (1); 3.98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16(1); 2,13(1); 1,96(2); 1,88(1); 1,34(1). 0,87 .(3); 0.84(3);

г) С-ЯМР спектр, который представлен на Рисунке 4 с сопутствующими пояснениями, демонстрирует следующие группы сиг- налов (ппм) при 125 мгц в DMCO-de с ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ппм), О означает четвертичные углеродные атомы или С 0-группы,

5

10

Q

5

Q я

5

0 5

0

5

173,69,0; 171.10; Q; 169,83,0; 169,51,0; 168,45, О; 168,26, О; 167,84, О; 165.68, О; 164,75, О: 161,40, О; 161,23 Q; 160,46, О; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,52. Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93 О; 144,73, О; 143,75, Q; 142,10 О; 141,78, О; 141,33, СН; 140,97, Q; 139.53, Q; 128,68. СН; 127,99, 2 fCHj, 127,67, Q; 127,67, СН; 126,88. СН; 126,76, 123,17, СН.; 118,65, СН; 116,42, СН; 73,81, СН; 69,41, СН2; 67.97, СН; 67,36, СН2; 60,12 СН; 58,63. СНз; 58.24, СН; 55,41, СН; 48,15, СН; 47,03, СН2; 41,19, СН2; 37,60, СН2; 34,06, СН; 29.76, СН2; 25,85, СНз; 24.28, СН2; 18.49, СНз; 17,98, СН3; 11,99, СНз;

д) время удерживания (Rt) 14,9 мин при анализе с помощью обращенно-фазовой HPL С при следующих условиях:

колонка: Ultrasphere (обращенная фаза силаниэированный силикагель, 5 микрометров (Altex) Beckman (4,6 мм (в.д.)х 250 Мм.

пред-колонка: Brownlee Labs RP18 (ок- тадецилсилаи силикагель, 5 микрометров), элюент А: ацетонитрил: 18 мм фосфат натрия 70:30(об./об.) доведенный до рН 7,0. элюент В: ацетонитрил: 18 мм фосфат натрия 10:90 (об./об.), доведен до рН 7,0

режим элюировзния: линейный градиент элюента А в элюенте В от 45%-до 70% за 20 мин

скорость потока: 1,8 мл/мин У.Ф. детектор: 254 нм внутренний стандарт: хлорамфеникол (,7 мин)

е) элементный анализ, после того, как образец предварительно высушен при около 140°С в инертной атмосфере, указывает следующий состав: углерод, водород, азот, сера,

ж) Rf значение 0,37 в следующей хрома- тографической системе:

дихлорметан:метанол 9:1 (об./об.), используя пластины силикагеля (силикагель 60 F254, MerckCo)

визуализация: УФ сиет при 254 нм, желтое пятно с парами иода или биоавтография, используя В. Subtllis ATCC 6633 -на минимальной среде Дэвиса; внутренний стандарт; хлорамфеникол (Rf 0,56)

з) FAB-MS анализ, показывающий наинизшую массу изотопа протонированного молекулярного иона при м/з 1290,3+0,1 дальтон. Все другие пики свыше 800 м/з единиц (не считая пиков изотопов) в спектре были менее, чем 20% от молекулярного иона, на основании анализа с помощью двойного фокусирующего масс-спектрометра Kratos MS-50 при следующих экспериментальных условиях: бомбардировка быстрыми атомами Хе при б кв: глицериневая матрица; режим положительной ионизации,

и) аминокислотный анализ солянокислого гидролизата, показывающий присутствие следующих природных аминокислот: глицин, (1)-пролин и (и)-серин, при следующих экспериментальных условиях;

образец гидролизуют при 105°С в течение 20 часов в присутствии 6 NHCI, содержащей 1% фенола, и затем получают производные в две стадии следующим образом:

1) образование н-пропиловых эфиров карбоновой кислоты функционализацией с 2 NHCI в безводном пропаноле (90°С, 1 час), и последующая сушка в атмосфере азота;

2) конверсия свободных аминогрупп в амидные с пентафторпропионовым ангидридом (безводным дихлорметаном, 1/9 (об/об) при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей сушкой в атмосфере азота,

функционализированный остаток, полученный таким образом, растворяют в дих- лорметане и анализируют GG-MS, используя НР5985В систему при следующих условиях:колонка: капиллярная колонка из плавленного кварца, покрытая хиральным.н-пропионшН-валин т-бутила- мид полисилоксаном (25 м х 0,2 мм в.д.; C.G.C. ANA LYTIC); температурная программа 80°С в течение 4 часов, затем 4°С/мин

к) ионизационные исследования

никаких поддающихся ионизации функций не определено титрованием с 0,1 NHCI и 0,1 NaOH в метилцеллозоль/вода; слабо основную функцию выявляют титрованием с 0,1 NHCIO4 в неводной среде (уксусная кислота),

л) Удельное вращение

альфа о20 +140,8; абсолютный этанол, при концентрации около 5 г/л.

Антимикробная активность соединений изобретения может быть продемонстрирована серией стандартных тестов In vitro MIG для Clostridium difficile, Propionlbacterlum acnes, и Bacteroldes fragllls путем агарового разбавления (инокуляты 1ft4 (FU). MIC для других организмов определяют разбавлением микробульона (инокула 104 до 105 CFU/мл). Инокуляты для Ureaplasma urealytlcum были приблизительно 104 цветовых изменений единиц/мл. Времена инкубации составляли 18-24 часов, кроме N.gonorrhoeae Branhamella catarrhalis, M.lnfluenzae, I.difficile, P.acnes и B.fragllls (48 ч). Все организмы инкубируют при около 37°С кроме Candida alblcans (30°C). N. gonorrhoeae и M.lnfluenzae инкубируют в 5%, С02 атмосфере, анеэробируют в смеси анаэробных газов. Использованные среды: Sso. Sensltest бульон (ОХо Id) (Staphylococcl, Streptococcus faecalis, Streptococcus faeclum Escherlchla coll, Pseudomonas

aerugtnosa. Proteus fulgares, Klebsiella pneumonia }; Todd. Hewltt бульон (Difco) (другие стрептококки); GC основания бульон (Difco) +1 % Sso fitalex BBL (N. gonorrhocal); бульон из настоя мозгов и сердца (Difco)

+1% добавка С (Difco) (M.influenzae), Mueller. Hlnton бульон (BBL) (Branhamella catarrhalis); AC среда (Difco); (C.pevfringens); Wilklns. Chalgren агар (Oxold) (другие анаэробы) Evans and Taylor

Robinson бульон (Difco), с добавками, для U.urealytlcum; дрожжевой азотный бульон (Difco) (Candida alficans).

Минимальные ингибиторные концентрации (MIG, микрограмм/мл) для некоторых

микроорганизмов сообщены ниже в табл. 4.

Активность антибиотика ОБ 2270 также подтверждается в экспериментах in vitro no отношению к клиническим изолятам enterococci.

В табл. 5 сообщаются результаты этих экспериментов.

Результаты, относящиеся к некоторым In vitro тестам по отношению к клинически- изолированным коагулазо-негативным Spaphylococci сообщены ниже в табл. 6.

Противомикробный спектр активности антибиотика GE 2270 включает также анаэробы, как показано согласно результатам in v tro эксперимента, сообщенным в табл. 7 ниже.

Активность по отношению к P. acnes подтверждают в in vitro эксперименте, включающем II клинических-изолированных штаммов, результаты которого приведены в табл.8.,„ . Бактерицидная активность по отношению к Enterococcus faecalis.

Кривые время-гибель получают в 10 мл Todd-He Witt бульона в 100 мл склянках Эрлеймейера, выдержанных при 37°С без перемешивания. Логарифмически растущую культуру Enterococcus faecalis штамма 1 149 инокулируют при 1,4хЮ7 CFU/мл. Указанный антибиотик/тейхопланин, 8. мг/л убивает 99% инфицирующих бактерий за 48 часов; в то время как антибиотик GE 2270 фактор А/О,12 мл/л) убивает 99,8% бактерий за 2 часа и 99,99% за 48 часов при этой дозе или за 24 часа при 4 мг/л.

Эта активность по отношению к Enterococcus faecalis распространяется также на штаммы, которые резистентны к гликопептидным антибиотикам.

Активность по отношению к Gardnerella vaglnalls 13 клинических изолятов vaglnalls испытывают на Gasman агаре с 5% кроличьей крови и 0.15% лизированной крови кролика (инокулят приблизительно 104 CPU). MIC антибиотика GE 2270 фактора А была в области 2-4 мг/л, MICso 2 мг/л. Инкубацию проводят в течение 48 часов при 37-С в анаэробной газовой смеси.

Эксперимент л ы г1 ис /1ышей.

Противомикробная активность соединений изобретения подтверждается также в экспериментальном ее сепсисе у мышей.

Группы из 8 мышей CDI обоих полов (Charles River, средний вес 18-22 г)инфици- руют внутрибрюшинно Staphybcoccus aureus ATCC 19636. Бактерицидное введение веществ 10 клеток/мышь) осуществляют в виде суспензии в 0,5 мл 5% микробиологического муцина (Difco). Тесто- вое соединение применяют внутривенно один раз немедленно после инфекции в стерильном водном растворе, содержащем 5% диметилформамида и 10% CremophorR EL) полиэтоксилиробанное касторовое масло).

EDso рассчитывают на седьмой день от процента оставшихся в живых животных при каждой дозе по методу Spearman and Raerber ее значение составляет 1,13 мг/кг.

Экспериментальный эндокардит у крыс

андокардйт БьГ/Гвызван у особей мужского пола CD крыс (Charles ),весящих около 200 г. Полиэтиленовый катетер (PP.25 Partex) вводят через клапан аорты в левый желудочек через правую сонную артерию и закрепляют шелковой лигатурой. Правильное положение катетера контролируют, используя усилитель записи (Hewlett Packard модель 7782А) с датчиком давления. Через два дня крыс инфицируют путем инъекции 0,5 мл раствора соли, содержащего ЮА CFU aures 1 1524. Лечение проводят в течение 5 дней, начиная с 16 час. После инфицирова- ния. Антибиотик GE 2270 фактор А, солюби- лизированный в пропиленгликоле: CremophorEI:5% глюкоза -(10:20:70, вводят I, v. 20 мг/кг дважды в день. Оставшихся в живых крыс убивают на шестой день после лечения и их сердца удаляют. Каждое животное, умершее до конца терапии, вскрывают и его сердце удаляют. Каждое сердце взвешивают и гомогенизируют, гомогенаты по- следовательно разбавляют и помещают на Todd-Hewitt агар, чтобы определить бактериальную нагрузку. Присутствие крови в полных сердечных гомогенатах не влияет на результаты, так как бактериальные титры в крови были всегда, по крайней мере, в 1000 раз ниже, чем сердечные нагрузки. Данные статистически проанализируют посредством Scheffe s сложного сравнительного теста. Тех крыс, которые умерли в течение 40 часов после заражения, исключают из статистического анализа. Результаты этого эксперимента приводятся в табл. 9.

Острая токсичность.

Тесты на острую токсичность, выполненные на мышах, показывают, что LDso для антибиотика GE 2270 фактор А выше, чем 100 мг/кг i.v. и выше, чем 500 мг/кг l.p. y того же вида животных.

Ввиду его свойств, соединение изобретения может быть использовано как активный ингредиент при приготовлении лекарственных препаратов для лечения человека или животного.

В частности, антибиотик GE 2270 фактор А является противомикробным агентом, главным образом, активным по отношению к грамположительным бактериям и грамо- положительным также как и грамотрица- тельным анаэробам. По-видимому, он также является очень активным в стафилококковом эндокардите без какой-либо кросс-ре- зистентности с метисиллинсм, аминогликозидами или гликопептидными антибиотиками. .

Главное терапевтическое показание антибактериального вещества изобретения заключается таким образом в лечении инфекций, относящихся к присутствию микроорганизма, чувствительного к нему.

Как полагают, термин лечение включает в себя также профилактику, терапию и лечение.

Пациент, получающий этот курс лечения, является любым нуждающимся в нем животным, включая приматов, в частности, людей, и других млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, свинья и овца, домашняя птица и домашние животные вообще.

Соединение изобретения может применяться как таковое или как добавка с фармацевтически приемлемыми носителями и может также применяться в соединении с другими противомикробными агентами, такие как пенициллины,цефалоспорины,ами- ногликозиды и гликопептиды. Объединенная терапия, таким образом, включает последовательное, одновременное и раздельное введение активного соединения путем, при котором терапевтические эффекты от первого приема еще полностью не исчезают.

На фиг. Т представлен УФ спектр антибиотика GE 2270 фактор А/Соответствие между символами примененными растворителями является следующим:

-- относится к образцу в СНзОН

О относится к образцу в 0,1 NHCI в относится к образцу о фосфатном буфере рН 7,4

относится к образцу в 0,1 N КОН На фиг. 2 представлен ИК-спектр поглощения антибиотика GE 2270 фактор А в нуй- оловой пасте.

На фиг. 3 представлен Н-ЯМР антибиотика GE 2270 фактор А, измеренный при 500 мгц в DMCO-de

На фиг. 4 представлен С-ЯМР антибиотика GE 2270 фактор А при 125 мгц в DMCO-de

П р и м е р 1. Получение антибиотика GE 2270.

Культуру Planoblspora rosea ATCC 53773 выращивают на агаровой питательной среде из овсяной муки в течение двух недель при 28-30°С и затем используют для инокуляции 500 мл склянки, содержащие 100 мл засевной среды следующего состава;

Крахмал20 г/л Полипептон 5 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л Мясной экстракт 2 г/л Соевая мука 2 г/л Карбонат кальция 1 г/л Дистиллированная ,. вода g.S 100мл (доведенная до рН 7,0 перед стерилизацией).

Склянку инкубируют на роторном встря- хивателе (200 об./мин) при 28-30°С в течение 92 часов. Полученную культуру затем используют для инокуляции в контейнерном ферментаторе, содержащем 4 литра той же самой среды и культуру инкубируют при 28- 30°С в течение 48 часов при перемешивании (около 900 об/мин) и аэрации (около одного стандартного литра воздуха на объем на Минуту).

Полученный бульон переносят в фер- ментатор, содержащий 50 л следующей продуцирующей среды:

Крахмал 20 г/л Пептон 2,5 г/л Гидролизованный казеин 2,5 г/л Дрожжевой экстракт 3 г/л Мясной экстракт , 2 г/л Соевая мука 2 г/л Карбонат кальция 1 г/л Дистиллированная вода g.s. (доведенная до рН 7,0 перед стерилизацией) и инкубируют в течение около 72 часор при28-30°С.

Противомикробную продукцию контролируют с помощью испытания агаровой пробы на бумажном диске, используя B.subtilis ATCC 6633, выращенном на минимальной среде Davis. Зоны ингибирования оценивают после инкубирования в течение ночи при 35°С.

П р и м е р 2. Выделение антибиотика GE2270,

Ферментированную массу (50 л), полученную выше, собирают и подвергают фильтрации в присутствии фильтрующего средства (Clarcell).

Антибиотик GE 2270 находится, глав- 5 ным образом, в мицелии, даже если некоторое количество его может быть выделено также из фильтратов,

а) Фильтрат доводят до около рН 7,0 и экстрагируют этилацетатом (50 л). Органи- 0 ческую фазу отделяют центрифугированием и концентрируют до небольшого объема при пониженном давлении. Полученный маслянистый остаток затем обрабатывают петролейным эфиром, чтобы осадить неочи- 5 щенкый антибиотик GE 2270, который собирают путем фильтрации и сушат. 415 мг неочищенного комплекса антибиотика GE 2270 получают.

в) Мицелий экстрагируют дважды 20 л 0 метанола и объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении, получая водный остаток, который дважды экстрагируют этилацетатом. Неочищенный антибиотик G Е 2270 (606 г) осаждают добав- 5 лением петролейного эфира из концентрированной органической фазы.

П р и м е р 3. Очистка антибиотика GE 2270 фактор А.

Сырец, полученный из.мицелия соглас- 0 но методике, описанной выше (Зг), растворяют в-тетрагидрофуране и концентрируют при пониженном давлении в присутствии силикагеля (230-400 меш). Полученный твердый остаток собирают и наносят на хро- 5 матографическую колонку, содержащую 300 г силикагеля (230-400 меш), приготовленного в метиленхлориде (CH2CI2). Колонку проявляют сначала метиленхлоридом (2 л) и затем последовательно 1,5 л смесей мети- 0 ленхлорида и метанола в следующих соотношениях; 98,2, 96/4, 94/6, 92/8, 90/10 .и 88/12 (об./об.).

фракции собирают, анализируют методами TLC, HPLC или микробиологически по 5 отношению к B.subtilis объединяют согласно содержанию в них антибиотика.

Объединенные фракции, содержащие чистый антибиотик GE 2270 фактор A (HPLC время удерживания 14,9 мин.см. Физико- химические данные, пункт Е, выше) концентрируют при пониженном давлении, получая маслянистый остаток, который солюби- лизируют тетрагидрофураном. Из этого раствора антибиотик GE 2270 фактор А (600 Mr) осаждают путем добавления петролей- його эфира.

П р и м е р 4. Другой урожай антибиотика GE 2270 фактор А получают из других фракций, выделенных с помощью выше описанной хроматаграфической системы, но которые содержат его в неочищенной форме (HPLC). Также эти фракции объединяют, Концентрируют и обрабатывают, чтобы получить твердое вещество, как описано выше. Этот .неочищенный препарат антибиотика СЕ 2270 фактор А очищают методом HPLC согласно следующей методике:

Часть этого осадка (6 мг) растворяют в смеси ацетонитрил: вода, 1:1 (об./об.) и вводят в HPLC хроматографическую систему, Снабженную колонкой с силанизированным силикагелем (Lichrosorb RP 18,7 микрометров, 250x10 мм., Merck Darmstadt.

Проводят элюирование смесью раствора А и В с линейным градиентом концентраций от 50% до 85% А и В, в течение 20 мин при скорости потока около 4 мл в мин, Раствор А представляет собой смесь ацетонит- рила и 18 мм буфера фосфата натрия 70/30 {об./об.), доведенную до рН 6, ото время как раствор В представляет собой смесь ацето- нитрилз и 18 мм фосфатного буфера, 10/90 (об./об.), доверенную до рН G.

Колонку присоединяют к Perkin Elmer LC 85 УФ детектор при 330 нм. Фракции I последовательных хроматографических опытов, имеющие однородное содержание, объединяют и концентрируют при пониженном давлении, чтобы удалить ацетонитрил, получал, таким образом, выделенные остаточные растворы, содержащие антибиотик GE 2270 фактор А. Эти растворы экстрагируют дважды равным объемом этилацетата м противомикробный продукт получают осаждением из концентрированной органической фазы путем добавления петролейного эфира. После выделения фильтрацией и высушивания получают 27 мг антибиотика GE 2270 фактор А.

Формула.изобретения

1. Штамм бактерий Pianobispora rosea АТСС 53773 - продуцент фактора А антибиотика GE 2270.

2. Способ получения фактора А антибиотика GE 2270, заключающийся в том, что культивируют штамм бактерий Pianobispora rosea ATCC 53773 в условиях глубинного погружения и аэрации в присутствии усваиваемых источников углерода, азота и минеральных солей при 24 - 35°С до оптимального накопления целевого продукта с последующим его выделением путем экстракции мицелия и фильтрата культуральноп жидкости.

3. Фактор А антибиотика GE 2270, имеющий следующие характеристики: а) ультрафиолетовый спектр поглощения, который демонстрирует следующий максимум.погло0 щенмя:

1%

5

Е1с 0,1 М НС

0,.1 М КОН

Фосфатный буфер рН7,4

/Uiatcc, им

245 (плечо)

310

245 (плечо)

313

Метанол

245 (ппбчгй 314 244 (плзчп) 265 310

б) инфракрасный спектр поглощения п

иуйолоаой посте, который демонстрирует

следующие максимумы поглощения., ():

3700-3060, 3060-2650 (нупол): 16130, 1ПУП1490, 1490-1420 (нуйол); 1375 (нуйсл): 13 10,

1245, 1210; 1165; 1090; 10GO; 1020; 970: 930;

840; 810:750; 720 (пупол); 700;

Главные функциональные полосы поглощения этого спектра могут бить отнесены как:

V, см Отнесение 3600-3100 Nil, ЮН 1650 амид l(vOO) 1545 гетероциклическая

vOC и vON 1525, 1495амид I (5NH)

1250, 1205

870

ароматическая ОСИ гетероциклическая YCH 745,700ароматическая YCH

в) Н-ЛМР спектр, который демонстрирует следующие группы смгналоп (в ррт) при 500 мГЧ-;, записанные в DMCQ-de (гексэ- дейтеродиметилсульфо.ксид). используя- ТМС в качестве внутреннего стандарта (0,00 ррт); число протонов для каждого сигнала дано в круглых скобках:

9,02 (1); 0,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1);

8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9);

6,96 (2), 6,02 (1); 6,30-6,18 (3); 5,10(1): 4,97(2);

4,80(1); 4,56(1); 4,30(П: 4,26 (I); 3,98(1): 3,01

(1); 3.79 (1); 3,38 (3); 2.72 (1); 2,50 (3): 2.48 СП;

2,16(1); 2,13(1); 1.98(2); 1,88(1); 1.34(1);ОД)7

(3); 0,84(3):

г) С-МР спектр, демонстрирующий следующие группы сигналов (ррт) при 125 мГц в DMCO-decTMC n качестве внутреннего стандарта (0,00 ppm), Q - четвертичные углеродные атомы или -группы:

173,69, Q; 171,10. Q; 169,830; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26 Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161.23. Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31. Q: 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78. Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128.68. CH; 127,99, 2 rCHj; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126,76, С CCHJ; 123,17, CH; 118,66, CH: 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36. CH2; 60,12, CH; 58,63, СНз; 58,24, CH; 55,41, CH; 48.15 CH; 47.03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2:34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, СНз; 11,99, СНз;

д) время удерживания (Rt) 14,9 мин при анализе с помощью обращенно-фазовой HPL С при следующих условиях: колонка: Uitrasphere PDS (обращенная фаза силани- зированный силикагель; 5 микрометров) Altex (Beckman) 4,6 мм (в.д) х 250 мм;

предколонка: Brownlee Labs RP 18 (ок- тадесилсилан силикагель; 5 микрометров);

элюент А: ацетонитрил: 18 ммоль фос- фат натрия 70:30 (об./об.), доведенный до рН 7,0

элюент В: ацетонитрил: 18 ммоль фосфат натрия 10:90 (об./об.), доведенный до рН 7,0;

режим элюирования: линейный градиент элюента А в элюенте В от 45 до 70% за 20 мин;

скорость потока: 1,8 мл/мин;

УФ-детектор: 254 нм;

внутренний стандарт: Хлорамфеникол (Rt 3,7 мин.)

е) элементный анализ, после того, как

образец предварительно высушен при

140°С а инертной атмосфере, указывают

следующий состав: углерод, водород, азот,

сера;

ж) Rt - 0,37 в хроматографи.ческой системе: дихлорметан: метанол, 9:1 (об./об.), используя пластины силикагеля (силикагель 60F254, Merck Co.); Визуализация; УФ-свет при 254 нм, желтое пятно с парами иода или биоавтография, используя B.subtills ATCC 6633 на минимальной среде Дэвиса: внут- . ренний стандарт: хлорамфеникол (Rf 0,56);

з) FAB-MS анализ, показывающий наинизшую массу изотопа протонированного молекулярного иона при м/з (1290,3+0,1) дальтон, все другие пики свыше 800 м/з

единиц (не считая пиков изотопа) в спектре были менеечем 20% от молекулярного иона, на основании анализа с помощью двойного фокусирующего масс-спектрометра Kratos MS-50 при следующих экспериментальных

условиях; бомбардировка быстрыми атомами Хе при 6 кВ; глицериновая матрица; режим положительной ионизации;

и) аминокислотный анализ солянокис- лотного гидролизата, пбказывающий присутствие следующих- природных аминокислот: глицин (1 }-пролин и (1)-серин, при следующих экспериментальных условиях: образец гидролизуют при 105°С в течение 20 ч в присутствии 6N HCI, содержащей

1% фенола, и затем получают производные в две стадии следующим образом: образование н-пропиловых эфиров карбоновой кислоты обработкой 2 н. HCI в безводном пропаноле(90°С, 1 ч), и последующая сушка

в атмосфере азота; конверсия свободных аминогрупп в амидные с пентафторпропио- новым ангидридом (безводным дихлормета- ном, 1/9 (о б./о б.) при комнатной температуре в течение 1 ч с последующей

сушкой в атмосфере азота; функционэлизи- рованный остаток,.полученный таким образом, растворяют в дихлорметане и анализируют CG-MS, используя НР5985В систему при следующих условиях: колонка:

капилллрна я колонка из плавленного кварца, покрытая хиральным н-пропионил-Ь-ва- лин т-бутиламид полисилоксаном (25 м х 0,2 мм в.д.; C.G.C. ANAL YTIC); температурная программа 80°С в течение 4 ч, затем

4°С/мин

к) ионизационные исследования; никакие ионизируемые функций не определяют титрованием с 0,1 н. HCI и 0,1 и. NaOH в смеси метилцешюзольв/вода; слабоосновную функцию выявляют титрованием 0,1 NaHCICM в неводной среде (уксусная кислота);

л) удельное вращение;

альфа о20 +140,8°С; абсолютный эта- нол, при концентрации около 5 г/л.

Таблица 1

Культуральные характеристики штамма Planoblspora rosea ATCC 53773

Питательные среды

Овсяный агар 6%

ISP 2 (дрожжевой

кстракт, солодовый

агар)

ISP3

/ISP4

P 5 (глицерин, аспа- рагин, агар)

SP б (пептон, дрожевой экстракт железо, агар) SP 7 (тирозин, агар)

Hichey и Fresner s агар

zapek, глюкоза, агар

люкоза, аспарагино- вый агар

Усиленный рост с однородной поверхностью, кораллово-красный (2-Н-10), обильная продукция светлокрасного воздушного мицелия (1-А-9).

Усиленный рост с морщинистой поверхностью (2-Е-9), след светлого воздушного мицелия

Умеренный рост с однородной поверхностью, светлокрасный (2-Е-8), след красновато-белого воздушного мицелия Умеренный рост с однородной поверхностью, кораллово-красный (2-Е-10) Умеренный рост с однородной и плоской поверхностью, светяокрасный (2-А-9), обильная продукция белого воздушного мицелия Умеренный рост, слегка сморщенный, светлокоралловый (I-A-10)

Умеренный рост с однородной и тонкой поверхностью, светлокрасный (1-А-9), обильное образование светло-красного (I-C-9)

воздушного мицелия

Усиленный рост с толстой и морщинистой поверхностью светяокораллокрасный (I-A- 10), умеренная продукция светлокрасного

воздушного мицелия

Очень скудный рост с однородной и поверхностью, умеренная продукция светлокрасного воздушного мицелия Умеренный рост с однородной и тонкой поверхностью, бесцветный, воздушный ми- целий отсутствует.

Морфологические характеристики

Питательный агар

Benett s агар алат кальция, агар

безжиренное молоко, агар

Яичный альбумин, агар

екстроза, триптоза,

агар Картофельный агар

Хороший рост с однородной поверхностью, светлооранжепый с краснвоатой окраской

(9-А-7)

Умеренный рост со слабо сморщенной поверхностью, светложелтый-красный (10-А-6) Бедный рост с однородной и плоской поверхностью, бесцветный Умеренный рост с однородной поверхностью, кораллово-красный (2-Г-9) Бедный рост с однородной и тонкой поверхностью, бесцветный до светло-красного

(2-А-8) Нет роста

Хороший рост с однородной поверхностью,

светлооранжевый с красноватой окраской

(9-А-7)

Примечание. Буква и числа относятся к цвету, определенному согласно MaerzА. и PaulM. Ren, 1950. ADlctionaryof Color, 2-nd Edition Me Graw-HIII Book Company Inc. New York.

Таблица.2 Физиологические характеристики Planobispora rosea ATCC 53733

Тесты

Гидролиз крахмала Образование сульфидов водорода б Тирозиновая реакция

Гидролиз казеина

Переваривание малата кальция

Разжижение желатина

Коагуляция молока

Пептонизация молока

Восстановление нитрата

Утилизация карбогидрата

Продолжение табл. 1

Результаты

положительный отрицательный

положительный слабо положительный

отрицательный слабо положительный отрицательный отрицательный положительный

Таблица 3

Фруктоза

Галактоза

Глюкоза

Рамноза

Лактоза

Цукроза

Мальтоза

Рафиноза

Целлюлоза

Маннит

Салицин

Инозит

Целлобиоза

Примечание: + - умеренный рост +/- - редкий рост - нет роста

Штамм

Staph. aureus Tour L 165

Staph. aureus Tour L 165(106 мл)

taph. aureus Tour L 165 + 30% бычьей сыворотки

Staph. epidermidls L147 ATCC 12228

Staph. haemolytlcus L 602 Staph. haemolyticus L 602 (106 мл)

Strep, pyogenes C203 Strep, pneumonlae UC41 Strep, faecalis ATCC 7080

Strep, mitis L 796 Clostrldium perfringens TSS 30543 с

Clostridium difficile ATCC 9689

Propionibacterium acnes ATCC 6919

Bacteroides fragilis ATCC 23745

Heisseria gonorrholae Is 68/126

Branhamella catarrhalls ATCC 8176

Haemophilus influenzae ATCC 19418

Ureaplasma urealyticum L 1479

Escherichia coli SRF 12140

Proteus vulgaris ATCC 881

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

Rleblella pneumonlae L 142

Candida albicans SRF 2270

Продолжение табл. 3

+/+

+

Таблица 4

M.I.C. (микрограмм/мл)

Антибиотик GE 2270 Фактор А

.0,25 0.25 0,25 0.13 0,51

0,25 0.13 0.13 0.13 0.03 0,03

0.004

2

32 1

128

32

128 128 128 128 128

Таблица 5 . Активность антибиотика GE 2270 по отношению к энтерококкам

Т а б леи ц а 6

Активность антибиотика GE 2270 по отношению к коагулазо-негативным

Staphylococci

Активность GE 2270 по отношению к анаэробам

Таблица 7

,Та бл и ц а 8 Активность антибиотика GE 2270 по отношению к P. aches

Активность антибиотика GE 2270 фактор А в стаффилококко- эндокардите у крыс

Хр 0,001 в сравнение с контрольными (лечеными или неле чеными с наполнителем)

) Бактериальная нагрузка на сердце в начале терапии 7, (значение +SD log 10 /g сердце для 5 животных)

MIC антибиотика GE 2270 фактор А для S. aureus L 1524 0,25 микрограмм/мл.

80604020

фиг.I

Таблица 9

- сн он

0.1N IIC1

phosphate buffer pll 7.4 0.1 Ы КОИ

4000

30002500 2000 18OO 1600 MOO

. Фиг. 2

lOCfo 80O60O

а ,

s

IV

f-Г

fiscal

ч

- а 1

-35

з

Js

ИЗ

3

-ъЗ