Способ получения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грамположительных бактерий Советский патент 1979 года по МПК C12D9/00 

Снятое молоко-агар: обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до светло-коричневого цвета, пятнистые тени. Агар Чапека: обильный рост, моредини тая поверхность, оранжевого ивета. Картофель: скудный рост, морщиниста структура, темно-оранжевого цвета. Желатина: скудный рост, светло-оранжевого цвета. Фиэиолого-биохимически свойства. Усваивает Cj - арабинозу, ксилозу, Cg-глюкозу, фруктозу, манно зу, маннит, инозит, раЯнозу, сахароз лактозу. Не усваивает рафинозу,целлюлозу, специальный салицин. Гидролизует крахмал, казеин, малат кальция. Сероводород образует, меланин не образует, реакция тирозиназы-отрица тельная. Нитраты восстанавливает. Лакмусовое молоко не коагулирует, но пептонизирует, разжижает желатину.„ Оптимум роста при 30 С в течение 6-14 дней. Для получения нового антибиотика штамм культивируют при анаэробных условиях в водной питательной среде содержащей усваиваемые источники углерода и азота, а также минеральные соли. Обычно культивируют в качалочной колбе до тех пор, пока не образуется соответствующее количество антибиотика, после чего культуру пересевают на ферментационную питательную ср ду в вибрационном ферментере. После этого продолжают культивировать при 25-35 0 при анаэробных условиях до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Концентрацию антибиотика контролируют в ходе культивирования микробиологическим путем по методу диффузии в чашке. После отфильтровывания мицелия антибиотик вьщеляют из ферментационного раствора известным путем, как, например, экстракцией органиче ким растворителем, в котором раство ряется антибиотик, но который не смешивается с водной средой. Экстра цию производят после доведения значения рН фильтрата до 2-4. При этом в качестве растворителей используют алканолы Ц-С , алкиловые эфи ры низких алифатических кислот или низкие галогенированные углеводороды. Растворитель вьщеляют из фермен тационного раствора путем центрифугирования при высоких скоростях, ко центрируют его до 1/200-1/400 nei ю начальногр объема, охлаждают и выце живают его до тех пор, пока не обра зуется осадок, который потом фильтруют. Он состоит из очень чистого антибиотика. Потом маточные раствор собирают и наливают в избыток инерт ного неполярного растворителя, как. например, масло, чем получают-еще определенное количество сырого антибиотика. Сырой продукт растворяют в смеси метанола с ацетоном и потом осаждают ,из раствора добавлением кислотной воды. Обе фракции соединяют и очищают путем хроматографии на колонке хлороформом и метанолом в качестве системы растворителей. Затем антибиотик перекристаллизовывают из метанола и этилацетата 1:1. Антибиотик показывает «п vttro о in viv& противобактериальную активность, особенно in vitro, прежде всего против грам-положительных бактерий. Ниже приведена минимальная ингибирующая концентрация (мик), мкг/мл, для различных штаммов Sto hyeocpccus dureub АТСС 6538 0,025 btaphy oc6cct/6 aureusTouv 0,025 Streptococcus hoemoEyticus С 203 0,0062 DipEococcus pnetimomaE UC41 0,p0078tEosWdium pertptr ens ISS 50545 0,012 MycopEosffla Ks tftom H21C.Z.В. 0,2. Кроме того, новый антибиотик превосходно действует tn vivo при вызванных экспериментально инфекциях в мышах. Значения ЭД антибиотика, обнаруженные при экспериментально вызванных инфекциях StophyEococcus aureus, StrqA)coccushaenjo yticu5,T)cocct/s pneumorиae сведены в нижеследующей таблице. ,МГ/КГ, подкожно St ptococcus haemotyticus0,2 StqDhyEococcus aurais10 OipEocQCcus pneumotriae0,4 Новый антибиотик также активен против микроорганизмов, которые устойчивы к обычно употребляемым антибиотикам. Токсичность антибиотика очень низка ( перорально или внутрибрюшинно у мышей 1000 мг/кг). Пример. Штамм JittinopEanes barvepcdK naib C.B.S- 305 76 предварительно культивируют в питательной среде при значении рН 6-10 до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Культуру выращивают в качалочной колбе на среде следующего состава, г/л: Мясной экстракт 3,0 Триптон5,0 Дрожжевой экстракт 5,0 Глюкоза1,0 Растворимый крахмал 24,0 Карбонат кальция 4,0 Дистиллированная вода (мл) До 1000. Потом колбы встряхивают в течение суток при 28-30с, после чего 1 л предварительных культур Пересевают на вибрационные ферментеры, содержащие 10 л питательной среды следующего состава, г s

Мясной экстракт40

Пептон40

Дрожжевой экстракт10

Хлорид натрия25

Соевая мука100

Глюкоза500

Карбонат кальция50 Водопроводная вода (мл) До 10.

Потом с размешиванием анаэробно инкубируют при 28-30 С. В определенных интервалах по методу диффузии в чашке/ микробиологически испытывают активность антибиотика с Stophy ococcus aureus в качестве подопытного организма.Максимальная активность достигается после 3-4 дней.

Выделение и очистка антибиотика.

80 л ферментационной жидкости фильтруют 1%-ным CEarcel(вес./об.) в качестве вспгалогательного средства для фильтрования. Мицелий выбрасывают и после подкисления отфильтрованного раствора 10%ной соляной кислотой до рН 2,5 его экстрагируют два раза этилацетатом, количество которого соответствует приблизительно 50% объема раствора.

Органическую фазу отделяют от водной центрифугированием при высоких скоростях, сушат ее NajSO, концентрируют при 45-50°С при вакууме до 1/300 первоначального объема, и охлаждают до 0-10 С.

Сырой осадок собирают на фильтре, лромывают значительным количеством этилацетата и сушат в вакууме при . Таким образом получают 1,140г антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты 70%.

Остающиеся после фильтрации маточные растворы наливают в 20 об./ч. легкого масла и получают еще 2,550г антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью частоты 20-25%. Это вещество суспендируют в незначительном количестве метанола и ацетона (9:1). Нерастворимые составные отфильтровывают, после чего разбавляют водой. Размешиванием 10%ной Соляной кислотой значение рН раствора доводят до 2,5. Таким образом полученный осадок собирают центрифугированием и растворяют в минимальном количестве бутанола при температурах 45-50 С. Раствор концентрируют в вакууме до 1/5 первоначального объема и охлаждают до 4 С. Полученный осадок собирают и .сушат в вакууме, получают (0,450 г) антибиотика с полученной спсктрофотометрическим путем степенью чистоты 80%. Полученные продукты потом продолжают очищать. Для этого их растворяют в минимальном

количестве хлороформа и метанола (85 15) и хроматографИРУют предварительно активированной при ЮОс колонкой Sitica -ceEite (1 : 1 061/06. и промывают смесью хлороформа/метанола.

Элюирование и тонкослойную хроматографию фракций производят той .же самой смесью. По данным тонкослойной хроматографии собранные фракции концентрируют в вакууме до незначительного объема. После добавки диэтилового эфира образуется осадок, состоящий из антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степень чистоты 95 %. Осадок растворяют в метаноле и этилацетате (1:1), нагревают до 45°С и фильтруют. После охлаждения до 4 с и .вьщерживания в течение ночи при той же самой температуре получают чистый антибиотик в виде светло-желтых игол,

Химико-Физические свойства антибиотика.

Антибиотик представляет собой порошок светло-желтого цвета, кристаллической структуры и кислотного характера. Анализ кислотного гидролизата антибиотика в 6 н.соляной кислоты в герметически запаянной трубке при показал 4 аминокислоты, три из которых в аминокислотном автоанализаторе были определены как аспарагиновая кислота, треонин и глицин. Точка плавления антибиотика 210°С.

Элементарный анализ, %:

С 51,35; Н 5,05; N 10,50; S 11,05;

О (при помощи разности) 22,05.

В ультрафиолетовой области видимые

спектры поглощения:

1%

,кc

ь

Е1 (см) 360 103 290 (плечо) 237 326

Ультрафиолетовые спектры поглощения устанавливают с помощью ультрафиолетового спектрофотометра в растворах с буфером метилцеллозольва (1:1) при различных значениях рН.

Антибиотик содержит сильно флуоресцирующий хромофор. Раствор активированного при 240 нм продукта в 0,1 н растворе едкого натра показывает эмиссионный спектр с максимумами при 355 и 490 нм.

Спектр флуоресценции был установлен с помощью спектрофотометра флуоресценции .

Характерные полосы поглощения в ньюелв были установлены при следующи частотах (см ) «

3400 (плечо), 3350 (сильно), 3200 (плечо), 3100 (сильно), 2930 и 2870 (ньюель), 2800-2400, .2380 (атмосферная двуокись углерода), 1750 (сильно), 1670 (сильно), 1620 (сильно), 1540 (сильно), 1480 (сильно), 1460 и 1380 (ньюель), 1420 (сильно), 1340 (сильно), 1320 (сильно), 1280 (сильно), 1240 (сильно), 1195 (сильно), 1170 (сильно), 1145 (сильно), 1120 (сильно), 1075 (широко), 1015 (сильно), 990 (сильно), 935 (сильно), 920 (широко), 900 (сильно), 865 (сильно), 840 (сильно), 800 (сильно), 770 (сильно), 755 (сильно), 740 (сильно), 20 (ньюель). Инфракрасный спектр был установлен с помощью спектрофотометра. Удельное вращение:

25

125 (,8% в метаноле

М.

хлороформе 1:1).

Соединение растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и смесях хлороформа и метанола, мало растворяется в хлороформе, метаноле смесях метанола и этилацетатаг ворах NaHCOj и ледяной уксусной кислоте, не растворяется в воде и остальных общепринятых органических .растворителях.

ПредлагаегФий способ обеспечивает получение антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактерий.

Формула изобретения

Способ полх чения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактери заключающийся в том, что штамм ctinopEpnes sarveparenSls C.B.S- 30576 выраврвают в аэробных условиях на toJTaTепьной среде,содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим вищелением целевого продукта.