Штамм актиномицета SтRертомYсеS VIRGINIae NRRL 15156 и 12525 - продуцент антибиотического комплекса А 41030 и способ получения антибиотического комплекса А 41030 Советский патент 1988 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

СМ

Изобретение относится к биотехно-ном С и К-метил-И -нитро-Н-нитрозологии и касается получения антибиоти-гуанидином получен мутант Streptomyков.сев virginiae,который депонирован в

Целью изобретения является изыска- той же коллекции под номером NRRL

ние штаммов - продуцентов нового ан-12525, тибиотического комплекса А 41030 и разработка способа его получения. Культурально-морфологические приШтамм Streptomyces virginiae 9Ы-знаки. Штамм KRRL 15156 продуцирует

делен из образца почвы собранной в JQхорошо развитый воздушный мицелий и

штате Индиана. Штамм депонирован вспорофоры спиралевидной формы, однаAgricultural Research Culture Collec-ко встречаются крючки и петли. Штамм

tion под номером NRRL 15156. Из это-iffiRL 12525 воздушного мицелия и спор

го штамма путем обработки митомици-ле образует.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается производства антибиотиков. Цель изобретения - изыскание новых штаммов - продуцентов антибиотика, эффективного против стафилококков и стрептококков, и разработка способа его получения. Антибиотический комплекс А 41030, содержащий факторы А, В, С, D, Е, F, G получают с помощью штаммов Streptomy-- ces virginiae, которые депонированы в коллекции NRRL под номерами 15156 и 12525. Продуцент выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли.. Культивирование ведут в глубинных аэробных условиях при перемешивании

реда ISP 2

SP 3

SP № 4

SP

NRRL 15156 Рост: обильный

Субстратный мицелий: 72.d.OY

Воздушный обильный мицелий: 63.1.brgY

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост: хороший

Субстратный серый мицелий: 93.У обильный

Воздушный мицелий: хороший

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост: обильный

Субстратный мицелий: 89.P.Y

Воздушный обильный мицелий: 63. brgY

I

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост: обильный

Субстратный мицелий: 89.р.Y

Воздушный обильный мицелий: 22.rgY

NBRL 12525 хороший

SO.gY.Y отсутствует

отсутствует плохой

серый

отсутствует

отсутствует плохой

отсутствует плохой

гар Чапека

РО

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост: умеренньй

Субстратный серый г мицелий: 26 4.1

Воздушный плохой мицелий: lO.pKgY

Растворимый пигмент: отсутствует

Рост: обильньй

Субстратньй мицелий: 72.d.OY

Воздушный обильный мицелий: 63.1.brgy

Растворимый

пигмент: отсутствует

Названия цветов указаны в соответствии с цветовой картой стандартны образцов № 2106 ISCC - KBS Centroid (1958) и Color Harmony Manual (4-е изд., 1958).

Физиолого-биохимические признаки. Оптимальная температура роста 10 - 34 С (NRRL 12525) и 10-37 С (NRRL 15156). Штамм NRRL 15156 хорошо усваивает целлобиозу, D-галактозу, D-глю козу, D-мапьтозу, D-рибозу, салицин, сукцинат натрия, плохо усваивает D-ФрУктозу, не усваивает ацетат натрия, D-арабинозу, L-арабинозу, изо- инозит, лактозу, D-маннит, мелибиозу раффинозу, рамнозу, сахарозу, D-Kси- лозу. Штамм NRRL 12525 хорошо усваи- вает целлобиозу, D-галактозу, D-глю- козу, В-мальтозу рПлохо усваивает салицин, сукцинат натрия, не усваивает аце тат натрия, D-арабинозу, L-арабинозу, D-фруктозу, изоинозит, лактозу, D-маннит, мелибиозу, раффинозу, рамнозу, D-рибозу, сахарозу, D-ксилозу.

Нитраты в нитриты не восстанарли- вают. Меланоидные пигменты продуцируют на среде ISP № 1 и ISP № 6, не продуцируют на среде ISP № 7. Снятое молоко частично гидролизуют. Крахмал не гидролизуют. Желатину не разжижают. Переносимость NaCl : NRRL 15156 4%, NRRL 12525 3%.

отсутствует

отсутствует

хороший

отсутствует

отсутствует

Предпочтительные источники азота - соевая крупа, соевая мука, арахисо- ва.4 мука, рыбная мука, мясной пептон, .свиная кровяная мука.

Предпочтительные источники углерода - декстрин, крахмал, манноза, глицерин, хлопковое масло.

Антагонистические свойства. Проявляет активность в отношении грамполо- жительных микроорганизмов, в том числе стафилококков и стрептококков.

Пример.

Готовят питательную среду следующего состава, г/л: декстрин 10,0; дрожжевой экстракт 1,0; ферментатив- ньй гидролизат казеина 2,0; мясной экстракт 1,0; CoCl - 6 0,01; де- понизированная вода до 1 л. рН сре- ды доводят до 7,3 с помощью 5 н.КаОН, стерилизуют, рН после стерилизации 6,9. Среду скашивают. Дпя засева среды используют споры штаммов 15156 или 12525 и инкубируют посевы в течение 6 дн. при 30°С. Споры смывают стерильной дистиллированной водой. 1 мл суспензии инокулируют 50 мл посевной среды следукщего состава, Y/m

глюкоза 20,0; соевая крупа или мука 15,0; жидкая кукурузная вытяжка 10,0; CaCOj 2,0; вода водопроводная до I л (для штамма NRRL 12525); глюкоза 15,0; декстрин 20,0; соевая мука или крупа 15,0; жидкая кукурузная вытяжка 10,0; CaCOj 2,0; водопроводная вода до 1 л (для штамма NERL 15156).

рН среды доводят до 6,5 с помощью 5 H.NaOH, после автоклавирования рН среды 7,0.

Посевной материал выращивают в 250-мш1лилитровой широкогорлой колбе Эрланмейера, содержащей 50 мл среды, при 30°С в течение 48 ч на встряхива ,теле, вращающемся по дуге с ti it 5 см со скоростью 250 об/мин.

Полученный инокулюм можно повторно вьфащивать по описанному методу для увеличения количества посевного материала либо в количестве около 1;% на объём среды использовать для засева ферментационной среды.

В 50 мл ферментационной среды вносят 1% (0,5 мл) посевного материала, при этом используют среду следующего состава, г/л: декстрин 30,0; соевая крупа 6,0; 1,0; FeS04-7 Н,0 0;005; 1,0; WaJWOj 1,0; СаСОз 2,0 (для штамма NRRL 12525 4,0); депонизированная вода до 1 л. добавляют в среду после ее автоклавирования.

Культуру выращивают в 250-мшти- литровой колбе Эрленмейера при тем- пературе примерно в течение 4- 5 дн. на встряхивател, вращакицемся по дуге d - 5 см при 250 об/мин,

Для воспроизведения способа в промьшшенном масштабе в 165-литровый ферментатор заливают 100 л среды ука- : заннрго состава, в которую вносят посевной материал штамма WRRL 12525, Ферментацию ведут в течение 210 ч при температуре около , Аэрацию осуществляют со скоростью 0,25 V воздуха/У культ,л;,/мин, пере- мещивание - со скоростью 200 об. ме- щалки/мин.

Пример 2. Полученную по примеру 1 культуральную жвдкость . фильтруют на фильтр-прессе с использованием диатомовой землИо Фильтрат наносят на колонку, содержащую 100л смолы Diaion , со скоростью протока 4 л/мин. Колонку промывают ло- следовательно 300 л воды и 1000 л смеси метанол:вода (1:3) со скоростью

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

4 л/мин. Элюирование проводят смесью метанолгвода (:1) со скоростью 6 л/мин и собирают фракции по 100 л, которые подвергают контролю на биолог гическую активность.

Фракции 2-15 объединяют концентрируют при пониженном давлении и концентрат лиофилизируют. Получают 220 г сьфца антибиотического комплекса.

10 г сырца растворяют в 5 л смеси метанол:вода ( 1 :1), доводят рН до 10,0 с помощью NaOH и фильтруют. Фильтрат наносят на колонку со скоростью 50 мл/мин (30-литровая колонка, заполненная Сефадексом G-:0, крупнодисперсная, уравновешен смесью метанолгвода 1:1). Содзржимое колонки злюируют смесью MI. .анол:вода (1:1) со скоростью 50 1: ш/мин, собирают фракции объемом 3 л. Фракции 13- 24 концентрируют при пониженном давлении и лиофилизирздат. Получают 35,7 г антибиотического комплекса.

Комплекс А 41030 раство жм в воде, разбавленной водной кислоте, разбавленном водном основании, смеси метанол: вода, этанол:вода, диметилформ- амиде и смеси диметилформамидгвода, диметилсульфоксиде, смеси диметил- сульфоксид:вода, ацетонитриле, ацетоне, этилацетате, тетрагидрофуране или метилешшорвде.

Антибиотический комплекс состоит из факторов А, В, С, D, Е, G,

Пример 3, Выделение фактора А,

8 г комплекса А 41030 растворяют в 200 мл растворителя (смесь вода: ацетонитрил:ИаС1 84:16:2 г/л) и фильтруют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали (8x100 см), заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе ,g .с размером, частиц 10-20 мкм. Содержимое колонки злюирутот со скоростью 60 мл/мин смесью вода:ацето- нитрил;НаСЬ. (84:1ё:2 г/л), фракции объемом 480 мл, Элюаты контролируют при 254 нм с использованием УФ-монитора ISCO, модель ИА-5 с оптической установкой типа 6. Отбирают фракции 52-79, обогащенные фактором А, объединяют их и концетитркруют при пониженном давлении до объема 500мл, Концентрат доводят до рН 8,2 е помощью NaOK и фильтруют. Фильтрат наносят со скоростью 15 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НРт20, помещенной в колонку 2,8x22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 400 мл воды с рН 2,5 до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элюирова- ние проводят смесью вода:ацетонитрил (8:2) со скоростью 15 мл/мин и собирают фракции по 1 л. Фракции анализируют на активность против Вас. sub- tills.

Кристаллический фактор А, который образуется во фракции 2, после охлаждения выделяют фильтрованием (389,6 мг). Фракция 1 и фильтрат фракции 2 порознь концентрирз т при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 731,8 и 514 мг фактора А соответственно.

Фактор А представляет собой белое крицталлическое твердое вещество. Элементньй анализ, %: С 56,44; Н 3,58j N 8,11; О 23,2; С1 8,29. Молекулярная масса 1231. Эмпирическая формула С„ ,g.

Электролитическое титрование фак- тора А в 66%-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие трех титруемых групп, имеющих рКа около 5,53; 7,60 и 10,37 с возможными дополнитель величинами рКа больше 10,5 (пер- воначальное значение рН 7,83). Удельное вращение: М - 19,6 (С 9,0 в диметилсульфоксиде).

Спектр инфракрасного поглощения в таблетках КВг. Наблюдаются следующие различимые максимумы абсорбции, 3448-3226 (сильная широкая), 1653 (сильная), 1610 (слабая), 1587 (средняя), 1515 (сильная), 1488 (слабая), 1429 (средняя), . 1227 (сильная), 1139V(средняя), 1064 (сильная) и 1010 (сильная).

УФ-спектрофотометрия в смеси ме- танол:вода (1:3) в кислотных и щелочных условиях 278 (11,100) нм (), в основной среде 298 (17,200) нм (.}.

Фактор А растворим в смесях спирта и воды, диметилсульфоксиде и диметилформамиде и их смесях с водой, разбавленных водных растворах кислот и оснований.

Пример 4. Выделение фактора В.

1 г антибиотического комплекса растворяют в 35 МП растворителя (аце- тонитрил:КаС1:вода 15:2:85 г/л) и раствор наносят на стеклянную колонку Мишель-Миллера размером 4,7x45 см для жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности, при низком давлении (HPIPLC), заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен RP-18 углеводородная фаза (С, ), химически связанной с силикагелем. Элю- ируют со скоростью 21 мл/мин тем же растворителем. Собирают фракции объемом 21 мл. Элюат контролируют при 280 нм с помощью УФ-детектора. Фракции 184-245 объединяют и концентри- . руют при пониженном давлении до объема 25 мл. Концентраты 7 аналогичных очисток объединяют, разбавляют до 1,4 л водой и наносят со скоростью 8-10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20, помещенной в колонку, предварительно уравновешенной водой. Колонку промьшают 600 мл воды до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элю- ирование проводят смесью вода:метанол (1:1) со скоростью 8-10 мл/мин и собирают фракции объемом 300 мл. Фракции анализируют на активность против Вас. subtllis. Фракции 1-5 объединяют, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 523 мг неочищенного фактора Б,

550 мг двух объединенных неочит щенных факторов В растворяют в 10 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибу- тиламин 75:25:0,ОЗМ, рН 7,8), при этом гидроксид тетрабутиламмония до- бавляют до полного растворения. Раст- во р наносят на колонку размером 2,8x59 см Мишель-Мюллера HPLPLC из стекла, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен RP-8 углеводородная фаза (Cg), химически связанной с силикагелем. Элюируют со скоростью 5 мл/мин тем же растворителем. Фракции объемом 27 мл анализируют на присутствие фактора В с помощью аналитической HPLC системы на колонке из нержавеющей стали размером 4,6x250 мм, заполненной смоой с размером частиц 100 мкм ЛиХро-- сорб ЕР-18. Растворитель, состоящий з воды, ацетонитрила и дибутиламина (82:18:0,ОЗМ, рН 2,5), пропускают о скоростью 1 мл/мин.

Фактор В обнаруживают при 225 нм. орцию элюата, обогащенную фактором , объемом 999-1296 мл концентрируют о объема 200 мл, концентрат разбавяют до объема 500 мл, доводят рН до ,0 фосфорной кислотой и добавляют 1.МГ/МЛ NaCl. Раствор наносят со коростью 20 мл/мин на 100 мл смолы

913951

Diaion НР-20 в колонке размером 2,8х X 22 см, предварительна уравновешенной водой. Колонку промывают 500 мл воды, доведенной до рН 2,5 водной с муравьиной кислотой, до полного отсутствия в промывной-йоде хлоридов. Содержимое колонки элюируют I л смеси вода:ацетонитрил (6;4) со скоростью 30 мл/мин, Элюат концентрируют 10 при пониженном давлении и лиофили- зируют. Получают 295,6 мг сырца фактора В.

285 мг препарата растворяют в 30мл смеси диметилформамид;вода (4:6) при .15 нагревании, затем охлаждают до комнатной температуры и вьщерживают в холодильнике. ФакТор В выпадает в осадок, который отделяют фильтрованием, промывают ацетоном и сушаг в вакууме. 20 Получают 84 мг фактора В.г

Фактор В - белое твердое вещество.: Элементный анализ, %: С 58,54; Н 4,21;} N 8,63} С1 5,96; О 22,66.:

Электрометрическое титрование в 25 66%-ном диметилформамвде в воде пока- зьшает присутствие двух титруеьслх групп при величинах рКа около 5,6 и 7,5 соответственно, с возможными дополнительными величинами рКа более 0 30 (начальная величина рН 6,22). Молекулярная масса 1197, Эмпирическая фор-/ мула .

Спектр инфракрасного поглощения в таблетке КВг. Наблюдаются следуняцие ос различимые максимумы поглощения, (сильная широкая), 1653 (сильная), 1610 (средняя), 1587 (слабая), J 515 (сильная), 1488 (слабая), 1429 (средняя), 1290 (слабая), 40 1227 (сильная), П39 (средняя), 1064 (сильная) и 1010 (сильная).

Максимумы УФ-поглощения в нейтраль- - ной, кислой и основной среде в смеси метанолгвода J:i (278) 9,600 им (€) 45 и 298 (16,800) нм (в) соответственно.

Фактор В растворяется в тех же растворителях, что и фактор А.

Пример 5. Вьделение факто50

ра С.

9,0 г комплекса А 41030 растворяют в 200 мл растворителя, состоящего из смеси вода:ацетонитрил:ИаС1 (83:17: :2 г/л), и раствор фильтруют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали размером 8x100 см, заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе с раз- мером частиц 10-20 мкм марки LP-I/C,g,

0

с 0

5

0

4610

Элюируют со скоростью 60 мл/мин тем же растворителем и собирают фракции объемом 480 мл. ЭJдаaт проверяют при 254 нм с использованием УФ-детек- тора ISCO модели ИА-5. Фракции 28- 52, обогащенные фактором С, объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты двух аналогичных очисток объединяют, фильтруют и наносят со скоростью 10 мл/шю на J 00 мл смолы Diaion НР-20 в колонке 2,8 х X 22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают водой (2л) до исчезновения в промывной воде хлоридов. Элюируют 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) скоростью 15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении я -чиофилизируют. Получают 2,75 г смеси факторов, обогащенной фактором С. 3,25 мг этой смеси растворяют в 25 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 80:20: :0,3 М, рН 7,8) при добавлении гид- роксида тетрабутиламмония до завер - шения растворения. Пробу смеси наносят на колонку из стекла Мишель-Миллера размером 2,8x59 см, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен RP-8, элюируют со скоростыо 4 мл/мин тем же растворителем. Фракции объемом по 28 мл анализируют на наличие фактора С с помощью аналитической хроматографии HPLC на колонке из нержавеющей стали размером 4,6 х X 150 мм, заполненной Нуклеосилом с размером частиц 10 мкм. Растворитель- вода:ацетонитрил:ацетат натрия (81:19:2 г/л, рН 6 с помощью ледяной уксусной кислоты). Пробу пропускают со скоростью 1 мл/мин.

Элюат проверяют при 254 нм с использованием ISCO, модель ИАг-5 УФ- детектора. Фракции объемом 28 мл анализируют на наличие фактора С с помощью аналитической хроматографии HPLC, как описано.

Часть элюата в количестве 4,2 - 5,1 л, обогащенного фактором С, кон- центрирзтот при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют и растворяют-при добавле-/ НИИ фосфорной кислоты до рН 1,7. В : , качестве ионного маркера добавляют NaCl 1 мл/мл. Образец наносят со скоростью 20 мл/мин на 100 мл смолы Dia,ion НР-20 в колонке размером 2,8х

111

X 22 см, предварительно уравновешенной водой. Колонку промьшают водной муравьиной кислотой с рН (300 мл до отсутствия хлоридов в промывной воде. Содержимое колонки элюируют 1 л растворителя (вода:ацетонитрил 16:4) со скоростью 30 мл/мин. Элюат собирают, концентрируют при пониженном давлении и лиофилизирз от. Пол уча ют 0,87 г частично очищенного фактора С. Полученный продукт растворяют в 20 мл растворителя (вода:ацетонитрил :дибутил амии 80:20:0,03 М, рН 7 с использованием Н,Р04) при добавле- НИИ гидроксида тетрабутиламмония до полного растворения. Образец хрома- тографируют на стеклянной колонке Мишель-Миллера размером 2,8x59 см, наполненной ЛиХропрен РР-8 с разме- ром частиц 25-40 мкм. Часть элюата в количестве 2,45-3,2 л концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты от 2 сходных очисток объединяют и обессоливают на колонке содержащей смолу Diaion НР-20, как описано. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 688 мг фактора С. 678 мг - фактора С растворяют в 60 мл смеси вода:ацетонитрил (6:4) при нагревании, затем раствор охлаждают и осаждают фактор С. Осадок отделяют фильтрованием, промьшают ацетоном и сушат под вакуумом. Получают 428 мг фактора С,

Фактор С антибиотика А 41030 - белое твердое вещество. Элементньй со- став, %: С 48,87; Н 4,39; N 6,16; С1 6,96; О 33,81. Электрометрическое титрование фактора С в 66%-ном диме- тилформамиде в воде показывает присутствие 2 титруемых групп при вели- чинах рКа около 5,5 и 7,1 соответственно с возможными значениями рКа больше 10.

Молекулярная масса около 1393. Эмпирическая формула .

Спектр инфракрасного поглощения в таблетке КВг. Наблюдаются следующие максимумы поглощения, 3448- 3226 (сильная, широкая), 1653 (силь- най), 1610 (средняя), 1587 (слабая), 1504 (сильная), 1481 (слабая),. 1429 (средняя), 1220 (сильная), 1136 (сильная), 1064 (слабая), 1053 (средняя), 1005 (сильная).

4612

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щелочной и нейтральной средах в смеси метанол:вода (1:1) 278 (8,400) и 298 (14,000) им () соответственно

Фактор С растворим в тех же растворителях, что и фактор А.

Пример 6. Выделение фактора D.

6,0 г комплекса растворяют в 200 м растворителя, состоящего из смеси вода: ацетонитрил :NaCl (83:17:2 г/л), и раствор фильтруют, фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали размером 8x100 см, заполненную 4 л сили- кагеля в обратной фазе LP-I/Gjo с размером частиц 10-20 мкм. Содержимое колонки элюируют со скоростью 60 мл/мин тем же растворителем, собирают фракции объемом 480 мл. Элюат проверяют аналогично методикам, описанным в примерах 3-5. Фракции 35 - 53 объединяют, концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты от 2 сходных очисток объединяют, разбавляют водой до объема 3 л, наносят со скоростью 8 - 10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 см), предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 300 мл воды до исчезновения хлоридов Элюируют 1 л растворителя (вода:ацетонитрил 6:4) со скоростью 8-10 мл/мин. Элюат концентрируют прн пониженном давлении и лиофилизи- руют. Получают 2,33 г смеси факторов, обогащенной фактором D.

1,15 г смеси факторов растворяют в 25 мл растворителя (вода:ацетонит- рил:дибутиламин 80:20:0,03 М, рН 7,8 с помощью ) с добавлением гидроксида тетрабутиламмокия до полного растворения. Образец наносят на стек- ляннзпо колонку Мишель-Миллера размет ром 2,8x59 см, заполненную смолой с размером частиц 25-40 мкм ЛиХропрен RP-8, и элюируют со скоростью 5 мл/мин тем же растворителем. Элюат проверяют отбирают порции объемом 2,6-3,4 л и концентрируют при пониженном давлении до объема 300 мл.

Концентраты от 3 аналогичных очисток объединяют и растворяют при добавлении фосфорной кислоты до рН 7,7. В качестве ионного маркера добавляют KaCl (1 мг/мл). Образец наносят со скоростью 20 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 ей ), предварительно уравновешенной водо й.

Колонку промывают 300 мл воды, рН 2,5 (водная муравьиная кислота) до исчезновения хлоридов в промьюных водах. Элюирутот 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) со скоростью 30 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 0,63 г частично очищенного фактора D. Этот продукт растворяют в 15 мл растворителя (вода:ацетонитрил:дибутиламин 80:20:0,03 М, рН 7,8, фосфорная кислота) с добавлением тетрабутиламмония до Полного растворения. Раствор хро- матографируют на ЛиХропрене -RP-S с размером частиц 25-40 мкм в стеклянной колонке Мишель-Миллер размером 2,8x59 см, как описано. 2,5-3,0 л концентрируют при пониженном давлении до объема около 200 мл. Концентрат обессоливают на колонке, содержащей смолу Diaion HP-20, как описано в примерах 3-4. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 193 мг частично очищенного фактора D.

259 мг 2 объединенных частично очищенных фракций фактора D растворяют в 6 мл растворителя, состоящего из смеси вода:ацетонитрил:двухосновной фосфат натрия (,ОЗМ, рН 7,8, фосфорная кислота), и доводят до рН 10 водным раствором 5 н.гидрок- сцца натрия. Раствор наносят на стеклянную колонку-Мишель-Миллера размером 2,8x59 см, наполненную Ли- Хропреном RP-8 с размером частиц 25- 40 мкм, элюируют со скоростью 4мл/мин тем же растворителем. Элюат проверяют как описано.

Порции элюата объемом 405-1134 мл концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл и обессоливают на колонке (как описано). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лио- яиофнлизируют. Ползгчают 1,04 г

50

филизируют. Получают 120 мг фактора D.

Фактор D антибиотика А 41030 - белое аморфное твердое вещество. Элементный анализ, %: С 54,46; Н 4,35; Ы 7,58; С1 4,27; О 29,34,

Электрометрическое титрование фактора D в 66%-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при рКа около 5,5 и 7,6 соответственно,с возможными дополни- тельными величинами рК более 10 (начальная рН 6,83.), Молекулярная масса около 1326,

смеси факторов, обогащенной фактор Е. 0,5 л лиофилизата растворяют в 10 мл растворителя (вода:ацетонитр :НаС1 84:14:2 г/л) и наносят «а ко ку Мишель-Миллера (как описано), Э ируют со скоростью 5 мл/гчшн тем же растворителем и собирают фракции п 25 мл. После анализа фракций элюат объемом 1520-1780 мл концентрируют при пониженном давлении до объема 50 мл,

Концентраты 3 аналогичных очист объединяют, разбавляют водой до 1 и наносят на колонку со скорост ю

Спектр инфракрасного поглощения фактора D в таблетке КВг. Наблюдаются следующие различимые максимумы аб- сорбции, см : 3448-3226 (сильная, широкая), 2959 (слабая), 1661 (сильная), 1592 (сильная), 1511 (сильная), 1429 (слабая), 1290 (слабая), 1227 (слабая), 1212 (средняя), 1163 (слабая), 1443 (слабая), 1053 (средняя) и 1010 (сильная).

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щеЛочной среде 278 (10,600) им (),в основной среде 298 (19,900) нм

(е).

Фактор D растворим в ах же растворителях, что и фактор А,

Пример 7, Впзделение фактора Е антибиотика А 41030.

0,3 г комплекса А 41030 растворяют в 30 мл растворителя (водагацетоиит- рил:ШаС1 85:15:2 г/л) и наносят на стеклянную колонку Мишель-Миллер размером 2,8x59 см, заполненную ЛиХропреном ВР-В с размером частиц 25 - 40 мкм, Элюирование осуществляют со скоростью 12 мл/мин тем же растворителем, собирают фракции по 24 мл и отбирают после контроля фракции 55122., обогащенные фактором Е. Фракции объединяют и концентрируют при пони- HeifflOM давлении до объема 50 мл.

Концентраты 13 .аналогичмых очисток объединяют, разбавляют до 1,5 л водой

и наносят со скоростью 5 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 см), предварительно уравновешенной водой. Колонку промывают 900 мл воды до исчезновения в/.промывных водах хлоридов. Элюируют смесью вода:метанол (1:1) со скоростью 10 мл/мин и собирают 300-миллилитро- йые фракции. Фракции 1-8 объединяют, концентрируют при пониженном давлении

0

смеси факторов, обогащенной фактором Е. 0,5 л лиофилизата растворяют в 10 мл растворителя (вода:ацетонитрил: :НаС1 84:14:2 г/л) и наносят «а колонку Мишель-Миллера (как описано), Элюируют со скоростью 5 мл/гчшн тем же растворителем и собирают фракции по . 25 мл. После анализа фракций элюат объемом 1520-1780 мл концентрируют при пониженном давлении до объема 50 мл,

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, разбавляют водой до 1 л и наносят на колонку со скорост ю

15

iO мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 см), уравновешенной водой. Колонку промывают 200 мл воды, доведенной до рН 2,5 водной муравьиной кислотой. Элюируют 0,5 л смеси вода:ацетонитрш1 (6:4) со скоростью 15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 202,2 мг частично очищенного фактора Е, концентрат растворяют в 4 мл раствори- теля (вода:ацетонитрил: WaCl 86:14: :2 г/л) и хроматографируют со скоростью 4 мл/мин на колонке Мишель- Миллер. 2060-2480 мл элюата, обогащенного фактором Е, концентрируют при пониженном давлении до объема 50 мл. Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют и обессоливают на колонке Diaion НР-20. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 24 мг фактора Е.

Фактор Е антибиотика А 41030 - белое твердое вещество. Элементш 1Й анализ, %: С 56,06; Н 4,06} N 8,53j С1 3,50; О 27,85.

Электрометрическое титрование фактора Е в 66%-ном диметилформамице в воде показало присутствие двух титруемых групп при величинах рКа около 5,8 и 7,7 соответственно с возможными дополнительными значениями рКа более 10 начальная величина рН 6,57 Молекулярная масса около П 63. Эмпири kecKBH формула .

Спектр инфракрасного поглощения фактора Е в таблетках КВг. Наблюдаются следзпощие различимые максимзжы поглощения, 3448-3226 (сильная, широкая), 1653 (сильная), 1600 (средняя), 1504 (сильная), 1429 (слабая), 1290 (слабая), 1198 (средняя), 1136 (слабая), 1064 (слабая) и 1010 (сильная).Максимум УФ-поглощения в щелочной или кислой среде 278 (8,500) им (в) и в основной среде 298 (15,500) им (6). Растворим в тех же растворителях что и фактор А.

Пример 8 Вьщеление фактор F антибиотика-А 4J030.

9 г комплекса растворяют в 200 мл растворителя (вода:ацетонитрил:НаС1 83:17:2 г/л) и раствор фильтруют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали размером 8xJOO см, заполненную 4 л силикагеля в обратной

10

5

20

39514616

фазе с размером частиц 10-20 мкм LprI/C,e.. Элюируют со скоростью 60 мл/мин тем же растворителем. Собирают фракции по 480 мл. Элюат проверяют при 254 нм с использованием УФ-детектора. Отобранные фракции анализируют на наличие фактора F с помощью аналитической .системы HPLPLC на колонке из стекла Мишель-Миллера размером 0,8x30 см, заполненной ЛиХро- преном RP-8 с размером частиц 25 - 40 мкм. Растворитель (вода:ацетонитрил :NaCl 84:15:2 г/л) пропускают со скоростью 4 мл/мин. Фракции 26-36 объ- единяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл.

Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, фильтруют и фильтрат наносят со скоростью 10 мл/мин на 100 мл смолы НР-20 в колонке размером 2,8x22 см, уравновешенной водой, Ко- лонку промьшают 900 мл воды. Элюируют 1 л смеси вода:ацетонитрил (6:4) со 25 скоростью 15 мл/мин. Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 2,€ г частично очищенного фактора F.

500 мг концентрата растворяют в 10 ют растворителя (вода:ацетонитрил: :NaCl 84:16:2 г/л), доведенного до рН 7,0 гидроксидом натрия. Раствор наносят на стеклянную колонку Мишель- Миллера размером 4,7x45 см., заполнен ную ЛиХропреном RP-18 с размером частиц 25-40 мкм. Элюируют со скоростью 6 мл/мин тем же растворителем. Собирают фракции по 24 мл. Порцию элюата после контроля объемом 1940-2520 мл концентрируют при пониженном давлении до объема 300-мл.

Концентраты 2 аналогичных очисток объединяют и наносят со скоростью 20 мл/мин на 100 .ш смолы Diaion дс НР-20 (2,8x22 см), уравновешенной водой. Колонку промывают 300 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кислотой. Элюируют 0,75 л смеси вода:ацетонитрил (6:4). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лиофилизируют. Получают 299 мг фактора F.

Фактор F антибиотика А 41030 - белое твердое вещество. Элементный анализ, %: С 51,39; И 3,96; 01 6,45; N 6,45; О 28,65.

Электрометрическое титрование в 66%-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при величинах рКа, соответст -

30

35

40

50

55

171

венно около 5,4 и 7,1 с возможными дополнительными величинами рКа больше 10 (начальная величина рН 5,93)., Молекулярная масса около 1555, Эмпи- рическая формула C-j, .

Инфракрасный спектр поглощения в таблетке КВг. Наблюдаются следующие различимые максимумы поглощения, см 3448-3226 (сильная, широкая), 1653 (сильная), 1600 (средняя), 1504 (сильная), 1429 (слабая), 1258 (слабая), 1227 (сильная), 1136 (сильная), 1075 (сильная), 1053 (сильная) и 1010 (сильная).

УФ-максимумы поглощения в кислой или щелочной среде, 278 .(9,300) нм (), в нейтральной среде 298 (14,500 нм (е).

Растворим в тех же растворителях, что и фактор А.

Пример9. Вьщеление фактора G антибиотика А 41030.,

8 г комплекса А 41030 растворяют в 200 мл растворителя водагацетонит рилгИаС 84:16:2 г/л) и фильтруют. Фильтрат наносят на колонку из нержавеющей стали (8x100 см), заполненную 4 л силикагеля в обратной фазе LP-I/C,g с размером частиц 10-20 мкм

Элюирование ведут со скоростью 60 мл/мин тем же растворителем и собирают фракции объемом 480 мл, фракции 22-35, обогащённые фактором G, объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема 500 мл. Концентраты 3 аналогичных очисток объединяют, доводят рН до 8,5 гидрок сидом натрия и фильтруют. Фильтрат наносят со скоростью 10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 см), уравновешенной водой. Колонку промывают 400 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кисло- той. Элюируют смесью вода:ацетонит- рил (6:4) со скоростью 15 мл/мин и собирают фракции по J л. Активные фракции объединяют, концентрируют при пониженном давлении и лиофили- зируют. Получают 2,85 г частично очищенного фактора G.

0,5 г концентрата растворяют в 10 мл растворителя (вода:ацетонитрш :дибутш1амин 80:20:0,63М5 рН 7,8, фосфорная кислота) с добавлением ди- бутиламина до полного растворения концентрата (конечная величина рН 8,2, Раствор наносят на колонку Мишель-Миллера HPLPLC размером 2,8х

5

0

5 о

Q

5

5

5

4618

х59 см, заполненную ЛиХропреном RP-8 с размером частиц 25-40 мкм. Колонку злюируют со скоростью 4 мл/мин тем же растворителем.

Фракции 54-74, обогащенные фактором G, объединяют с фракциями 2 аналогичных очисток и наносят со скоростью 10 мл/мин на 100 мл смолы Diaion НР-20 в колонке (2,8x22 см),,уравновешенной водой. Колонку промывают 300 мл воды, доведенной до рН 2,5 муравьиной кислотой. Элюируют 0,75 л смеси вода: :ацетонитрил (6i4). Элюат концентрируют при пониженном давлении и лио- филизируют. Получают 960 мг фактора G.

Фактор G антибиотик:. А ЧЮЗО - белое твердое вещество. Элементный анализ, %: С 50,02; И С1 4,74; N 6,11; О 30,70.

Электрометрическое титрование в 66%-ном диметилформамиде в воде показывает присутствие двух титруемых групп при величинах рКа соответст- i венно около 5,4 и 7,0 с возможными дополнительными значениями рКа больше 10,5 (начальная величина рН 6,32).

Молекулярная масса около 1684.

Спектр ИК-поглощения в таблетках КВг. Наблюдаются следующие различимые максимумы поглощения, см 3320 (очень широкая, сильная), 2975 (резкая, слабая), 2920 (резкая, слабая), 1659 (нормальная, сильная), 1594- (широкая, сильная), 15J2 (резкад, сильная), 1492 (плечо), 1430 (резкая, слабая), 1386 (широкая, слабая), 1337 (широкая, слабая), 1308 (резкая, слабая), 1264 (резкая, слабая), 1230 (широкая, средняя), 1145 (широкая, средняя), 1077 (резкая, средняя), 1062 (резкая, средняя), 1014 (резкая, средняя) и 846 (широкая, средняя).

Максимумы УФ-поглощения в кислой или щелочной среде 278 (15,000) нм (е), в нейтральной среде 298 (18,000) нм (). ,

Фактор G антибиотика А 41030 растворим в тех же растворителях, что и фактор А.

Поскольку несколько факторов являются амфотерными, содержащими аминогруппу, и/или выполняют функцию кар- боновой кислоты, они способны образо-. вьюать сОли с кислотами и/или основаниями такими, как серная, фосфорная, соляная, уксусная, янтарная, лимонная, молочная, малеиновая, фумарино-. вая, пальмитиновая, холевая, памовая.

НО

сн ,сн

I

о NH

VAi

1Ш

п

° ш сн

ческого комплекса вьщеляют фактор НА 41030 структурной формулы .

21

1ш сн0. С

он он

НО - СН NH О Ш1

II I

о-с-сн

ч кн сн

CHz о. /СН

.0 да

X, НН СН

он он

6, Способ по п. 2, отличающийся тем, что из антибиотино-сн

/к

0 С 1Ш.,С

I л

о тш

и I НО-С - СН

но

он

С1 но

22

0

1ш нСН20. СНх

CHs,

1Ш

1Ш.

но

галактоза-G

ческого комплекса выделяют фактор D А 41030 структурной формулы

Шг ч о .СН.

irTT г/

™.о н

но-сн

/ w дно 0 V V ин с

о н но-с-сн

С-0

сн

1Ш.

. /

С1 но Галактозилг НО ОН ОНГалактоза О

Приоритет по признакам:22.11.82 штамм Str. virginiae NRRL

jc

ческого комплекса вьщеляют фактор F структурной фо1Я4улы

С-0

сн

15156.