Способ дифференциации штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 A61B10/00 

средой Игла, остатки среды отсасывают и клетки лизируют 0,7% тритока Х-100 в 0,6 М КС1, 0.05М - трис НС1, рН 7,5, с 200 мкг/мл гепарина при 4 С в течение 20 мин. Лизат центрифугируют при 4°С 10 мин при 1200 об/мин, надосадок собирают и используют в реакции иммуносорбции.

В качестве сорбента используют JQ взвесь протеин А-сефарозы CL-4B, которую перед употреблением трижды отмывают суспендированием в 10-кратных объемах сорбирующего буфера (СВ, 0,15М, NaCl, 0,001 М ЭДТА, 0,05 М}5

трис НС1, рН 8,0) с последующим осаждением на центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 мин. После отмывки осадок, суспендированный в солевом буфере (СВ в виде 10%-ной суспензии),20 смешивают с равным объемом (по200мкл) сыворотки крови переболевших ГЛПС людей из Европейской части СССР и с Дальнего Востока и встряхивают в теКлеточные лиэаты

Количество меченого материала в составе РНП, изолированных иммуносорбцией, срт

Из клеток, инфицированных штаммом CG-1820503 300 Из неинфицированных клеток

(контроль)12 220

Из клеток, инфит цированных штаммом 459096 300 Из неинфицированных клеток (контроль)18 850

Из таблицы видно, что количество меченого материала, содержащегося в

чение 1 ч на холоду, затем инкубируют 25 составе РНП в опытных пробах, значипри 4 С 16 ч. По окончании инкубации образовавшиеся иммуносорбентные комплексы (протеин А-сефароза - антите- ло) отмывают дважды СВ с 0,25% альбумина, один раз с альбумином и гепари- ,д ном (200 мкг/мл) и используют в реакции иммуносорбции в виде 10%-ной суспензии в СБ с альбумином и гепарином. К 200 мкл 10%-ной иммуносорбентной суспензии добавляют по 1 мл осветлен35

ного лизэта, смесь инкубируют 1 ч на холоду, периодически встряхивая. Образовавшиеся комплексы протеин А-се- фароза - антитело - антиген осаждают при 5000 об/мин 5 мин. Осадки отмывают дважды СБ, содержащим 200 мкг/мл гепарина и 0,05% тритона Х-100. Во второй отмывке концентрацию NaCl доводят до 0,5 М. После отмывки осадки

35

40

тельно превышает его содержание в контрольных пробах. Это свидетельствует об образовании в опытных пробах иммунных комплексов (РНП-антитело). Взаимодействие антител сывороток ре- конвалесцентов с нуклеокапсидными белками рибонуклеопротеидных комплек сов, изолированных из клеток, инфици рованных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, подтверждает принадлежность этих штаммов к роду Hantavirus и свидетельствует о специфичности реакции иммуносорбции.

Для проведения дифференциации штаммов по индивидуальной электрофо- ретической подвижности геномных РНК из изолированных РНП экстрагируют РНК. Для этого к иммуносорбентным

суспендируют в 0,8 мл НТЭ (0,1 MNaCl, комплексам, суспендированным в НТЭ,

0,01 М трис НС1, рН 7,4, 0,001 М ЭДТА) и отбирают аликвоты для определения кислотонерастворимой радиоактивности.

Для контроля на специфичность реакции иммуносорбции рибонуклеопротеи- дов (РНП) из лизатов клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, аналогичные операции про- водят с лизатами из неинфицированных клеток.

1 Результаты определения специфичности реакции иммуносорбции приведены в таблице.

50

55

добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1%, проназу с конечной концентрацией 200 мкг/мл и равный объем фенола, насыщенного НТЭ Депротеинизацию РНК проводят дважды и РНК преципитируют 2,5 объемами перегнанного этанола. Экстрагированные РНК анализируют электрофорезом, в 2,4%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевины, 18 ч при 100 с последующей обработкой для радио- автографии.

В результате проведенных исследований определено, что геном анализилиэаты

Количество меченого материала в составе РНП, изолированных иммуносорбцией, срт

Из клеток, инфицированных штаммом CG-1820503 Из неинфицированных клеток

(контроль)12

Из клеток, инфит цированных штаммом 459096 Из неинфицированных клеток (контроль)18

Из таблицы видно, что количество меченого материала, содержащегося в

д

5

0

тельно превышает его содержание в контрольных пробах. Это свидетельствует об образовании в опытных пробах иммунных комплексов (РНП-антитело). Взаимодействие антител сывороток ре- конвалесцентов с нуклеокапсидными белками рибонуклеопротеидных комплексов, изолированных из клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, подтверждает принадлежность этих штаммов к роду Hantavirus и свидетельствует о специфичности реакции иммуносорбции.

Для проведения дифференциации штаммов по индивидуальной электрофо- ретической подвижности геномных РНК из изолированных РНП экстрагируют РНК. Для этого к иммуносорбентным

0

5

добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1%, проназу с конечной концентрацией 200 мкг/мл и равный объем фенола, насыщенного НТЭ. Депротеинизацию РНК проводят дважды и РНК преципитируют 2,5 объемами перегнанного этанола. Экстрагированные РНК анализируют электрофорезом, в 2,4%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевины, 18 ч при 100 V с последующей обработкой для радио- автографии.

В результате проведенных исследований определено, что геном анализи

5156

руемых штаммов вируса ГЛПС представ- лен тремя сегментами РНК - L, M, S. Анализ электрофоретической подвижности геномных РНК штаммов 4590 (дорожка 3) и CG-1820 (дорожка 4) выявил различие между штаммами. S-сегмент штамма 4590 имел большую электрофоре- тическую подвижность в геле по сравнению с S-сегментом штамма CG-1S20.

Таким образом, применяя предлагаемый способ, удалось дифференцировать штаммы вируса ГЛПС, циркулирующие на Дальнем Востоке и в Европейской части СССР, по относительной подвижности их геномных сегментов, выделенных из внутрицитоплазматических РНП. Способ отличается простотой и эффективностью Простота достигается тем, что в отличие от способа-прототипа исключаются такие этапы, как очистка и концентрация вируса, связанные с ультрацентрифугированием. Введенные этапы являются менее трудоемкими и не требуют специальной квалификации персонала. Эффективность способа заключается в том, что на первом этане исследования он позволяет сделать заключение о

принадлежности исследуемого материала к роду Хантавирус.

Метод может найти применение также при изучении вирусов, характеризующихся низкой репродуктивной способностью (например, ар енавиру со в).

Формула изобретения

Способ дифференциации штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий идентификацию родовой принадлежности виру- совгизолятов с последующим определением штаммовой принадлежности путем анализа электрофоретической подвижности вирусных геномных РНК, отличающийся тем, что, с целью . упрощения способа и повышения его точности, идентификацию родовой принадлежности изолятов вируса осуществляют путем анализа радиоактивности комплекса протеин А-сефароза - антитело с рибонуклеотидами из лизатов культур клеток, выращенных в присутствии Н -уридина и инфицированных вирусами-изолятами.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторных исследованиях при изучении вируса-возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Целью изобретения является упрощение и повышение точности способа. Цель достигается тем, что клетки инфицируют штаммами вируса ГЛПС, после инфицирования получают щитоплазматический лизат, из которого путем инкубации с иммунными антителами, фиксированными на сорбенте, изолируют специфические рибонуклеопротеидные комплексы (РНП), характеризующие принадлежность исследуемого материала к роду Хантавирус. Экстракцию ДНК проводят из изолированных РНП электрофорезом в полиакриламидном геле, определяют индивидуальную электрофоретическую подвижность геномных РНК, по которой выявляют сходство или различие между штаммами ГЛПС. 1 табл.