Способ приготовления диагностикума для экспресс-индикации вирусов Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, конкретно к способам идентификации и индикации вирусов.

Цель изобретения - упрощение способа приготовления диагностикума для экспрес- синдикации вирусов.

Пример1.В качестве реагента используют пылевидную черную массу головни кукурузы (хламидоспоры гриба Sorosporium relllanum). Технология изготовления предлагаемого диагностикума заключается в следующем.

Отвешивают 90,0±0,5 мкг пылевидной черной массы головни кукурузы и два-три раза отмывают в 0,01 М фосфатно-соле- вом буфере (ФСБ). Эти и все последующие процедуры отмывания осуществляют путем осаждения хламидоспоровых частиц при 4000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендирования осадка в ФСБ. Затем взвесь головни фиксируют раствором формальдегида в концентрации 1,5% в течение 1,5 ч. Фиксацию проводят при постоянном перемешивании. После фиксации суспензию хламидоспор четыре раза отмывают в ФСБ от формальдегида. При необходимости длительного хранения (до 6 мес) взвесь хламидоспор головни добавляют в мертиолят или азид натрия в конечной концентрации 1:1000-1:10000.

После процедуры фиксации (или консервации) осуществляют сенсибилизацию Sorosporium relllanum гипериммунной или диагностическими коммерческими сыворотками против энтеровирусов. Для этого к 0,3 мл иммунной сыворотки против вирусов, разведенной 1:100 и более (в зависимости от исходного титра), добавляют 1,0 мл 10%О 00

VJ о

ной взвеси хламидоспор. Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37°С, тщательно перемешивая, По окончании процесса к содержимому флакона добавляют 5,0 мл 0,01 М ФСБ и переносят в центрифужный стакан. После однократного отмывания в ФСБ и осаждения центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин к осадку добавляют 10,0 мл 0,01 М ФСБ с 0,05%-ным твином.

Приготовленный по указанной технологии диагностикум готов для использования в реакции агглютинации.

П р и м е р 2. Осуществляют экспресс- идентификацию 41 изолятов энтеровиру- сов, выделенных от больных детей серозным менингитом. В качестве реагента используют пылевидную черную массу хламидоспор Sorosporlum reillanum. Диагностикум для экспресс-индикации вирусов готовят аналогично описанному.

На предметное с текло (на белом фоне) стерильной микропипеткой наносят 1 каплю диагностикума и каплю ФСБ (для контроля штаммов на спонтанную агглютинацию). Затем микропипеткой берут исследуемый изолят и соединяют с диагностикумом. Покачивая стекло, наблюдают наступающую агглютинацию. Реакцию коагглютинации (РК) учитывают в течение 30 с - 2 мин. Специфичность РК контролируют в реакциях между Sorosporlum reillanum, сенсибилизированной типовыми иммунными сыворотками и их смесями, и гомологичными, гетерологич- ными стандартными штаммами вирусов ECHO 1-6, Коксаки А и В и т.п. Результаты РК учитывают по 4-крестовой шкале:

(+++) - полная коагглютинация, резко положительная;

(+++-)-хорошо выраженная коагглютинация, положительная;

(-н--)- неполная коагглютинация, слабоположительная;

(+) - еле заметная коагглютинация,

слабоположительная;

() - отсутствие коагглютинации,

отрицательная.

Заключение о принадлежности штамма делают на основании положительной реакции не менее чем на +++ при наличии указанных контролей.

Идентификацию изолятов, выделенных из материала (фекалии, носоглоточные смывы, ликвор) от больных серозным менингитом в реакции коагглютинации, проводят в два этапа. На первом этапе используют Sorosporum reillanum, сенсибилизированную смесями иммунных сывороток к эн- теровирусам, а на втором - реагент, обработанный типоспецифическими сыворотками. Результаты идентификации на первом этапе показывают, что в 35 (85,4%)

и 6 (14,6%) случаев изоляты относились к вирусам ECHO 1-6 и Коксаки В 1-6. Окончательная идентификация энтеровирусов (на втором этапе) в реакции коагглютинации показывают, что вирусы ECHO 1-6 распределились следующим образом:.ECHO 1-2; ECHO 2-3; ECHO 3-1; ECHO 5-6 и ECHO 6-23 штамма. Вирусы Коксаки В 1-6 распределились следующим образом: Коксаки В 1-3; В 2-2 и В 6-1 штамм. Подобные результаты получены при использовании традиционного метода, т.е. стафилококкового реагента из штамма Со Wan 1. Результаты окончательной идентификации изолятов следующие: Коксаки В 1-3; В 2-1 и В 6-2

штамма; ECHO 1-2; ECHO 1-2; ECHO 2-4; ECHO 5-7 и ECHO 6-21 штамм. Процент совпадения результатов, определенных известным и предлагаемым способами, составил 95,8%.

П р и м е р 3. Осуществляют выявление ротавирусных антигенов в фекальных экстрактах больных острым гастроэнтеритом, а также в образ цах сточных вод и воды открытых водоемов. Анализ проводят по изложенной методике.

Результаты показаны в таблице. Проводимые сравнительные исследования показывают, что предлагаемый способ приготовления диагностикума для экспресс-анализа антигенов не уступает по чувствительности и специфичности известному способу,

Формула изобретения Способ приготовления диагностикума для экспресс-индикации вирусов, включающий конъюгацию антител с твердотельным носителем, приготовленным на основе клеток микроорганизма, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве твердотельного носителя используют хламидоспоры Sorosporlum reilianum.

Сравнение чувствительности и специфичности определения ротавирусного антигена известным и предлагаемым способами в реакции коагглютинации

Изобретение относится к вирусологии, конкретно к способам идентификации и индикации вирусов. Цель изобретения - упрощение способа приготовления ди- агностикума для экспресс-индикации вирусов. Это достигается использованием в качестве твердотельного носителя на основе микроорганизма хламидоспор Sorosporium relllanum. Сенсибилизация их гипериммунными сыворотками позволяет осуществлять индикацию и идентификацию знтеро- и ротавирусов в реакции агглютинации. 1 табл.

Примечание .Чувствительность (PKSR и PKSt положительные/PKSt положительные) х х 100; специфичность (PKSR и PKSt отрицательные/PKSt отрицательные) х 100; совпадение ((PKSR и PKSt положительные) + (PKSR и PKSt OTDH4aTeflbHbie)/(PKSR и PKSt положительные + PKSt отрицательные)) х 100.