Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий РSеUDомоNаS SYRINGae 1 - 9 серогрупп Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 C12Q1/00 

1 млрд кл./мл, 3-я инъекция - 2 млрд кл./мл, 4-я инъекция - 3 млрд кл./мл.

Интервалы между инъекциями 5 дн. Забор крови через 11-13 дн. после инъекций. Титры полученных антисывороток 1:25600- 1:52200.

Корпускулярнуюсуспензию

Staphylococcus aureus шт. Cowan-l готовят путем культивирования стафилококка на мя- сопептонном агаре при 37°С в течение 12- 18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80°С 1 ч, отмывания и обработки 50%-ным раствором этанола в течение 30 мин при 37°С.

Коньюгацию сыворотки с суспензией проводят при 37°С в течение 30 мин с последующей отмывкой не присоединившихся к белку А балластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 - 1:20. Обработка только нагреванием не обеспечивает необходимой активности и стабильности белок А содержащих клеток. О наличии активного белка А на стафилококковых клетках после различных процедур приготовления стафилококковой суспензии судят по способности корпускул стафилококка агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные иммуноглобулинами в реакции непрямой гемагг- лютинации, а также непосредственно в процессе определения антигенов P.syrlngae. При постановке реакции непрямой гемагглютинации в ряд лунок микропланшет вносят последовательности разведения взвеси стафилококка (0,05 мл) и 0,05 мл эритроцитарного диагностикума, представляющего собой тонизированные эритроциты, обработанные кроличьей сывороткой (титр 1:12.800). Установлено, что мак- симальное разведение стафилококковой суспензии, при котором наблюдается отчетливая агглютинация сенсибилизированных эритроцитов, 1-105 кл./мл. Для стафилококка, обработанного известным способом - формалином 1 -109 кл./мл, отсутствие активности для стафилококка, обработанного лишь нагреванием, при постановке реакции через 24 ч и более после приготовления стафилококковой суспензии.

Разрушение протеолитических ферментов, инактивация стафилококка, закрепление на его поверхности активного в иммунологическом отношении белка А происходит при нагревании при 80°С 1 ч в сочетании с обработкой 50%-ным раствором этанола. При более низкой, чем 80°С, температуре факторы патогенности стафилококка не инактивируются в течение 1 ч, при более

высокой температуре наблюдается экстракция белка А, разрушение клеток, что естественно влияет на качество реагента.

16-18-часовая агаровая культура стафилококка применяется в связи с тем, что, используя для получения биомассы жидкие питательные среды (МПБ и пептонно-дрож- жевую среду), был получен меньший выход биомассы на одинаковый объем питатель0 ной среды. При сокращении времени культивирования до 12-14 ч значительно уменьшается выход биомассы, а при увеличении до 20-48 ч наблюдаются потери активного белка А, который, видимо,

5 подвергается действию протеолитических ферментов.

Staphylococcus aureus шт, Cowan-l получен из Чехословацкой коллекции микроорганизмов, в клеточной стенке этого штамма

0 содержится большее количество клеточно- связанного белка А по сравнению со штаммом АТСС 12598.

Реагент не снижает свою активность при хранении при 4°С 2 мес, а его составная

5 часть - суспензия клеток стафилококка - до 5. Активность реагента сохраняется в течение 1 года при хранении при 4°С, а его составной части - суспензии клеток стафилококка - более 1 года.

0 П р и м е р 1. Реагент для экспресс-индикации антигенов P. Syrlngae получают следующим путем: стабильную инактивиро- ванную и активную по белку А суспензию золотистого стафилококка штамма Cowan-l

5 как составную часть реагента получают прогреванием 12-18-часовой агаровой культуры стафилококка, смытый физиологическим раствором; тепловой обработки при 80°С 1 ч, отмывают центрифугированием при 3

0 тыс. об/мин 15 мин, после чего обрабатывают осажденные и убитые клетки 50%-ным раствором этанола с целью стабилизации клеток и белка А. Обработку этанслом продолжают 30 мин при 37°С. Затем клетки

5 снова осаждают, отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию до 10% и хранят при 4°С с добавлением мерти- олята или азида натрия более 1 года без потери активности.

0 Для сенсибилизации стафилококка антисывороткой к 10%-ной суспензии стафилококка вносят поливалентную сыворотку к Pseudomonas syrlngae из расчета 0,1 мл сыворотки на 1 мл 10%-ной клеточной суспен5 зии стафилококка. После 30-минутного инкубирования при 37°С не связавшиеся с белком А иммуноглобулины удаляют путем центрифугирования при 3 тыс. об./мин 15 мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе до 1-5%-ной концентрации. Приготовленный таким образом реагент для экспресс-индикации антигенов P.syringae хранится при 4°С в течение 1 года без потери активности.

П р и м е р 2. Для экспресс-индикации антигенов P.syringae на обработанное этанолом стекло пипеткой наносят 0,025 мл (1 капля) реагента для экспресс-индикации антигенов P.syringae и 0,05 мл (2 капли) суспензии клеток исследуемых бактерий в кон- центрации 1-Ю8 кл/мл. Результат учитывают в течение 1 мин (табл.1). Как видно из табл.1, корпускулярные антигены исследованных штаммов представителей всех серогрупп вида P. syringae по классификационной схеме Пастушенко Л.Т., Симонович И.Д. взаимодействовали с реагентом для экспресс-индикации антигенов P.surlngae. Антигены бактерий других видов и родов с полученным реагентом давали отрицательный результат, что говорите высокой специфичности реагента в отношении антигенов P.syringae.

П р и м е р 3. Влияние концентрации стафилококковой суспензии и ее соотношение с антисывороткой, используемые при приготовлении реагента на чувствительность реакции реагента с антигенами P.syringae. Эти данные приведены в табл. 2 и 3.

Использование 15%-ной взвеси стафилококка затрудняет учет реакции в результате высокой густоты суспензии при визуальной оценке наиболее четко реакция проявляется при использовании 10%-ной суспензии стафилококка. Таким образом, 10%-ная суспензия стафилококка является оптимальной при визуальном учете.

Как видно из табл.3, оптимальным соотношением сыворотки и суспензии стафилококка является 1:10.

П р и м е р 4. Сравнение активности реагента, полученного по известному способу (с применением формальдегида), с предложенным. Получение реагента и постановка реакций агглютинации проводилась так, как было описано ранее. Для сравнения использовали стафилококковую суспензию, фиксированную раствором формальдегида 0,5 - 3 ч, отмытую и прогретую при 80°С 1 ч, и приготовленную предложенным способом. При обработке микробной массы стафилококка формальдегидом положительная реакция наблюдалась при концентрации 1-10 кл/мл. оценивался на 2 + и учет реакции проводилась через 40-50 мин после ее постановки. При меньших концентрациях антиген P.syringae не выявлялся. Та же биомасса, термообработанная и

входящая затем в состав реагента, опреде ляла тот же антиген в концентрациях 1 -10 1-Ю6 кл/мл в течение 30 с - 15 мин v реакция при этом оценивалась на 4+. 5Пример 5. Сравнительные данные

способов приготовления стафилококковой суспензии и сорбции поливалентной сыворотки к P.syringae. Сорбционную емкость определяли как количество мг белка сыво10 ротки, сорбировавшегося на клетках стафилококка, и выражали в процентах по отношению к концентрации белков сыворотки. Данные представлены в табл. 4-6. Как видно из табл.4, чем меньше ороки

15 культивирования Staphylococcus aureus шт. Cowan-l, тем большей сорбционной емкостью в отношении иммуноглобулинов поливалентной сыворотки к P.syringae обладают его клетки. Но культивировать

0 стафилококк менее 12 ч нецелесообразно, так как значительно понижается выход биомассы, это неудобно также методически. Целесообразно культивировать стафилококк с целью получения специфического реагента

5 12-18 ч, считая оптимальным время культивирования 14-16 ч.

Как видно из табл. 5, наибольшей сорбционной емкостью обладает стафилококк, прогретый при 80°С. Хотя сорбционная ем0 кость такого стафилококка ниже по сравнению с сорбционной емкостью живой культуры, но работать с такой биомассой более безопасно, кроме того, можно хра- нить более длительное время без потери

5 активности, так как инактивируются проте- олитйческие ферменты.

Для более полной инактивации стафилококков, а также с целью увеличения срока сохранения активности в связи со стабили0 зацией клеток и закрепления на их поверхности белка А, прогретую биомассу дополнительно обрабатывали этанолом разной концентрации (табл.5).

Таким образом способ позволяет пол5 учить более чувствительный реагент к антигенам P.syringae 1-9 серогрупп.

Формула изобретения

0 Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae 1-9 серогрупп, включающий приготовление кроличьей поливалентной иммунной сыворотки к указанным

5 бактериям, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности реагента, поливалентную сыворотку смешивают в соотношении 1:5-1:20 с 5-10%-ной агаровой суспензией Staphylococcus aureus

Cowan-l, инактивированной при 80°С в течение одного часа и обработанной 50%-ным раствором этанола в течение 30 мин при

37°С, смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин и отмывают неприсоединившиеся к белку А балластные вещества.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии, в частности к иммунохимическим методам экспресидентификации фитопатогенных бактерий PSEUDOMONAS SYRINGAE. Целью изобретения является повышение чувствительности реагента. Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий PSEUDOMONAS SYRINGAE заключается в следующем. Иммунную поливалентную сыворотку к 1 - 9 серогруппам P. SYRINGAE готовят путем механического смешивания в равных объемах серогрупповых сывороток, полученных иммунизацией кроликов штаммами, принадлежащими к 1 - 9 серогруппе. Титр полученных антисывороток 1 : 25600 - 1:52200. Корпускулярную суспензию STAPHYLOCOCCUS AUREUS шт. COWAN - 1 готовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37°С в течение 12 - 18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80°С 1 ч, отмывания и обработки 50%-ным раствором этанола в течение 30 мин при 37°С. Реагент готовят коньюгацией сыворотки с суспензией стафилококка при 37°С в течение 30 мин с последующей отмывкой неприсоединившихся к белку А баластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 - 1:20. Способ позволяет получить более чувствительный реагент к антигенам PSEUDOMONAS SYRINGAE 1 - 9 серогрупп. 6 табл.

Таблица 1

Индикация корпускулярных антигенов Р Syringae с помощью реагента для экспресс-индикации антигенов P. Syringae

Вид

Примечание:- отсутствие реакции; ++++ положительная реакция на 4 плюса по общепринятой оценке

Штамм Серо- Результат группа реакции

Зависимость чувствительности реакции от концентрации стафилококковой суспензии при

приготовлении реагента

Таблица 4

Определение сорбционной емкости 10%-ной суспензии живых клеток Staphylococcus aureus-шт. Cowan-I в отношении поливалентной антисыворотки к P. Syringae

Таблиц а 2

Т а в л и ц а

Определение сорбционной емкости ЮХ-ной инактияированной в разных температурных режимах суспензии Rranhvlococcus aureus шт. Cpwan-I в отношении поливалентной Лнтиеы- воротки к P.Syringae

Температура, °С

I

Сорвционная емкость, Ж

57,77 58,74 73,30 65,53

Таблица 6

Определение.сорвционной «мкости ЮХ-ной инактивированной нагреванием и обработанной этанолом разной концентрации суспензии Staphylococcua aureus ит. Cownn-I в отношении поливалентной антисыворотки к P. Syringae

10

Концентрация этанола. 7.

Сорбционнай емкость,

30 40 50 60

57,77 61,65 66,02 65,53