1-(АМИНОАЦИЛ)АМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФОКИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Советский патент 1994 года по МПК C07C309/47 C07C309/51 C12Q1/06 

Изобретение относится к новым химическим соединениям, в частности к 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислотам общей формулы
, где R - остаток лейцил, N-бензоилфенилаланил, карбобензоксиаргинил, тозилглицилпролиларгинил, N-третбутилоксикарбонилвалил, которые могут найти применение в качестве субстрата для определения амидазной активности ферментов, и способу их получения.

Целью данного изобретения является изыскание новых аминоацилпроизводных, которые не обладают канцерогенным действием по сравнению с известными аналогами, используемыми по тому же назначению, и разработка нового способа их получения.

П р и м е р 1. Тетрабутиламмонийная соль 1-аминонафталин-5-сульфокислоты.

5 г (25 ммоль) 1-аминонафталин-5-сульфокислоты и 65 г (25 ммоль) 10% -ного водного раствора гидроокиси тетрабутиламмония перемешивают 10 мин до растворения. Полученный раствор упаривают при пониженном давлении, остатки воды удаляют азеотропной отгонкой в смеси бензоэтанол. После перекристаллизации из той же смеси кристаллы сушат в вакууме. Дальнейшая очистка для определения физических свойств производится перекристаллизацией из воды.

Получают 10,5 г (95% от теоретического) тетрабутиламмонийной соли 1-аминонафталин-5-сульфокислоты. Бесцветные, на воздухе постепенно розовеющие листочки при УФ-облучении обладают голубой флюоресценцией. Т. пл. 158^оС. УФ λ _макс 328 нм, 246 нм (Н₂О).

Найдено, % : С 67,66; Н 9,71, N 6,01.

C₂₆H₄₄N₂SO₃
Вычислено, % : C 67,20; Н 9,54, N 6,03.

П р и м е р 2. 1-(1-лейцил)-аминонафталин-5-сульфокислота.

5 г (21 ммоль) 1-карбобензоксилейцина, 9,5 г (21 ммоль) тетрабутиламмонийной соли 1-аминонафталин-5-сульфокислоты, 2,8 (21 ммоль) оксибензотриазола растворяют при перемешивании и защите от влаги воздуха в 20 мл диметилформамида. При 0 ± 5 добавляют 4,5 г (22 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивают 20 ч при 20^оС, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, осадок промывают 3 мл диметилформамида. К фильтрату добавляют 40 мл этилацетата и при интенсивном перемешивании 120 мл петролейного эфира. Верхний слой отбрасывают, нижний повторно переосаждают описанным выше способом. К полутвердому остатку добавляют 10 мл толуола, упаривают при пониженном давлении, добавляют 15 мл HBr в уксусной кислоте (концентрация 3 моль HBr на 1 л раствора) и перемешивают 2 ч, защищая от влаги воздуха. К полученному раствору при перемешивании добавляют 70 мл эфира, растворитель декантируют, осадок промывают эфиром, этанолом, растворяют в 5% -ном водном Na₂CO₃ и при перемешивании осаждают 1 н. HCl. Выпавшие белые кристаллы отфильтровывают, промывают 0,1 н. HCl, растворяют в 5% -ном водном Na₂CO₃, экстрагируют изоамиловым спиртом и после упаривания при пониженном давлении получают 1,6 г белого кристаллического продукта. Растворением в воде и подкислением 0,1 н. HCl получают 1,4 г 1-(1-лейцил)аминонафталин-5-сульфокислоты. Дополнительные количества вещества получают упариванием и экстракцией маточных растворов. Общий выход 2,1 г (27% от теоретического).

Белый кристаллический порошок малорастворим в воде, растворим в водных растворах щелочей. Растворы обладают синей флюоресценцией при УФ-облучении. R_f= 0,40 в системе: (бутанол 4, CH₃COOH 1, H₂O 2). На хроматограммах обнаруживается по флюоресценции, проявляется 0,2% -ным раствором нингидрина в ацетоне, не взаимодействует с диазотированным 4-нитроанилином. Т. пл. 350^оС (с разложением, α ²⁵_D 14^о (1= 5 см, 0,2 М водный трис(оксиметил)аминометан), УФ λ _макс 292 нм, λ _макс 265 нм (вода).

Найдено, % : С 57,24, Н 5,85, N 8,17
Брутто-формула C₁₆H₂₀N₂SO₃
Вычислено, % : C 57,13, H 5,99, N 8,33.

П р и м е р 3. 1-(1N^αкарбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-сульфокислота. 1,55 г (5 ммоль) 1N^α-карбобензоксиаргинина и 1 г (5 ммоль) 1-аминонафталин-5-сульфокислоты суспендируют в 30 мл этанола, добавляют 3 мл триэтиламина и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток трижды упаривают из смеси этанол-бензол (соотношение 1: 1) при пониженном давлении и растворяют в 20 мл диметилформамида. К раствору добавляют 10 мл CH₂Cl₂, 0,7 г оксибензотриазола и при охлаждении до 0-(-5)^оС 1 г (5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 20 ч при 20^оС, СН₂Cl₂ отгоняют при пониженном давлении, после фильтрования к раствору добавляют 20 мл 1н. HCl и 40 мл изобутанола. Верхний слой отделяют и нейтрализуют 1М водным Na₂CO₃. Выпавший осадок экстрагируют 1н горячей НСl. Выпавшие при охлаждении кристаллы промывают этанолом, эфиром и сушат в вакууме.

Получено 850 мг (33% от теоретического) 1-(1N^α-карбобензоксиаргинил) аминонафталин-5-сульфокислоты. Т. пл. - выше 200^оС разлагается. Растворима в диметилформамиде, малорастворима в воде, этаноле, нерастворима в эфире. Водные растворы обладают голубой флюоресценцией при УФ-облучении. УФ: λ _макс 288 нм, λ _макс 252 нм (вода). R_f 0,48 (бутанол 4, СH₃COOH 1, H₂O 2). На хроматограммах обнаруживается по флюоресценции и нафтолгипобромитной реакцией, не проявляется нингидрином и диазотированным 4-нитроанилином. α ²⁵_D -6^о(1= 2 см, диметилформамид).

Найдено, % : C 50,60; H 5,81; N 11.

Брутто-формула C₂₄H₂₇N₅SO₆.

Вычислено, % : C 50,65; H 5,58; N 18,46.

Примеры 4-9, приведенные в табл. 1, дополнительно иллюстрируют получение 1-(аминоацил)аминонафталинсульфокислот.

Примеры 10-16 иллюстрируют применение 1-(аминоацил)аминонафталинсульфокислот или их солей в качестве субстратов для определения амидазной активности ферментов.

П р и м е р 10. Определение активности трипсина по разложению 1- 1N^α-карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-сульфо- кислоты.

2 мл реакционной смеси, содержащей 5 x x10^-4 М 1 (1N^α-карбобензоксиаргинил)-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 8,2), помещают в кювету спектрофотометра, термостатируют при 25^оС, добавляют 50 мкл исследуемого фермента, и в режиме повторного сканирования с интервалом в 5 мин записывают спектр в области 400-240 нм. Величину ферментативной активности определяют по приросту поглощения в области 330 нм или по убыли поглощения в области 280 нм. Абсолютные величины определяют по молярной экстинкции 1-аминонафталин-5-сульфокислоты, относительные - по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору фермента, приведенной на чертеже.

Примеры 11-16 приведены в табл. 2.

Таким образом, применение 1-(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфокислот в качестве субстратов для определения амидазной активности ферментов позволяет исключить использование канцерогенного 2-нафтиламина, применяемого по известному способу, и заменить его на неканцерогенную 1-аминонафталин-5-сульфокислоту при сохранении чувствительности. Дополнительным преимуществом применения 1-(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфокислот является возможность проведения измерений в водных средах за счет присутствия сульфогруппы, повышающей растворимость субстрата и продукта реакции в воде, а не водно-органических средах, что имело место с известным субстратом. Способ получения кислот позволяет провести избирательно с образованием С-N-связи и с сохранением оптической чистоты целевого продукта.

(56) Органические реакции. М. : Мир, 1965, т. 12, с. 174.

Лазарев Н. В. Вредные вещества в промышленности. Т. 2, Химия, 1976, с. 347.

Khorana H. G. Canadian journal of Chemistry, vol. 31, 585-588.

Изобретение касается замещенных ароматических сульфокислот, в частности 1-(аминоацил) аминонафталин-5-сульфокислоты (СК), в которой ацильный остаток представляет собой лейцил, N-бензоилфенилаланил, карбобензоксиаргинил, тозилглицилпролиларгинил, N-третбутилоксикарбонилвалил, которые могут найти применение в качестве субстрата для определения амидазной активности ферментов. Для выявления соединений, позволяющих определять активность ферментов, среди замещенных указанного ряда веществ были получены новые СК. Их синтез ведут из соли 1-аминонафталин-5-сульфокислоты и соответствующей аминокислоты, в которой защищена аминогруппа, в среде растворителя, например, диметилформамида, в присутствии конденсирующего агента - дициклогексилкарбодиимида и оксибензотриазола в течение 12 - 24 ч. Выделение целевого продукта ведут, например, осаждением органическим растворителем, экстракцией, хроматографированием, кристаллизацией. Удаление защитной группы, например карбобензоксигруппы, ведут обработкой HBr в уксусной кислоте. Испытания СК показывают, что они в сравнении с известным 2-нафталином не имеют вредного действия и позволяют вести измерения в водной среде. 2 с. и 1 з. п. ф-лы, 1 ил, 2 табл.

1. 1-(Аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислоты общей формулы

где R - остаток лейцил, N-бензоилфенилаланил-, карбобензоксиаргинил, тозилглицилпролиларгинил, N-трет-бутилоксикарбонилвалил,
в качестве субстрата для определения амидазной активности ферментов. 2. Способ получения 1-(аминоацил)-аминонафталин-5-сульфокислоты общей формулы
/
где R₁ - остаток лейцил-, N-бензоилфенилаланил-, карбобензоксиаргинил, тозилглицилпролиларгинил, N-третубтоксикарбонилвалили,
отличающийся тем, что соль аминонафталин-5-сульфокислоты
/
где М⁺ - ион тетрабутиламмония,
триэтиламмония пиридиния подвергают взаимодействию с N-ациламинокислотой общей формулы R₁OH, где R₁ имеет указанные значения, в присутствии дициклогексикарбодиимида в среде органического апротонного растворителя, выбранного из группы HCON(CH₃)₂, CH₂Cl₂, CHCl₃ или их смесей, при (-5) -- (+20)^oС. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что процесс ведут в присутствии N-оксибензотриазола.