Способ спектрометрического определения амидазной активности ферментов и детектируемая группа для его осуществления Советский патент 1987 года по МПК G01J3/40 C07C143/60 

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам

анализа ферментов, гидролизующих амидные связи.

Изобретение может быть использо- вано в пищевой, фото, микробиологи- ческой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.

Целью изобретения является ускоре- ю кие и упрощение процесса.

Способ заключается в следующем.

.Для определения амидазной ферментативной активности с помощью 1-(ами ноадил)аминонафталин-5 сульфокислот последние вводят в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, оптимальный для исследуемого фермента, ругие компоненты, необходимые для проявления ферментативной активности (меркаптоэтанол, комплексоны, неорганические ионы и др.), смесь термоста- тируют, добавляют фермент и измеряют изменение оптической плотности либо в области поглощения продукта (330 им), .);ибо в области поглощения субстрата (280 нм). Первое предпочтительно, так как другие соединения, обычно находящиеся в смеси, в этой области не поглощают.30

Пример 1. Определение актив- ности трипсина по разложению арбобензоксиаргинил)аминонафталин-5- сульфокислоты.

15

25

20

2 мл реакционный смеси, содержащей 5-10 М 1 N -карбобензоксиарги35

lO- M

нил)-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М трис-НС1-буфере рН 8,2, помещают в кювету спектрофотометра, термостатируют при 25 или 37% добав- 40 синтеза; наличие ЗОзН-группы, увелипротеаз, в том числе протеаз крови, а в качестве субстратов для определения активности ферментов соответственно используют 1-(аминоацил)амино- нафталин-5-сульфокислоты (или их соли) . Дополнительными преимуществами 1-аминонафталин-5-сульфокисл6ты в качестве хромофорной группы ферментных субстратов являются интенсивная флюоресценция, что позволяет контролировать ход процесса на всех стадиях

чивающеи растворимость в водных растворах; способность к азосочетанию как в виде азо-, так и после предварительного диазотирования, диазоком- понент с образованием интенсивно окрашенных красителей и; доступность (1-аминонафталин-5-сульфокислота применяется в качестве исходного соединения при синтезе красителей, выпуск ее освоен промьшшенностью и проводится в значительных масштабах).

ляют 50 мкм исследуемого фермента и в режиме повторного сканирования за- письшают спектр в области 400±240 нм Величину ферментативной активности определяют по приросту поглощения в области 330 нм или по убыли поглощения в области 280 нм. Абсолютные величины определяют по молярной экс- тинкции 1-аминонафталин-5-сульфокис- лоты, относительные - по калибровоч- ной кривой, построенной по стандартному раствору фермента.

Пример2. 2мп реакционной смеси, содержащей бромгидрат лейциламинонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 М тр ис-НС1-буфере рН 7,6, термостатируют при 25 С, добавляют

10 мкл исследуемого препарата - Про назы (смесь протеиназ, используемая

0

в биохимических исследованиях), инкубируют 10 мин, добавляют 1 мл 0,1 М раствора NaOH, измеряют оптическую плотность при 330 нм относительного . раствора, в который фермент добавляют непосредственно перед измерением. Результаты по примерам 3-6 приведены в табл. 1.

Ускорение и упрощение процесса достигается за счет исключения операций экстракции, центрифугирования в ,связи с тем, что используемая в качестве детектируемой группы 1-а:мино5 нафталин-5-сульфокислота растворима в водньк растворах, и в отличие от 2-(аминоацил)-1-нафтиламинов, используемых по прототипу, не является канцерогенной и является легко доступной. Преимущество предлагаемого способа перед прототипом приведено в табл. 2 и 3.

В качестве детектируемой группы предложена 1-аминонафталин-5-сульфо5 кислота, не являющаяся канцерогенной, достаточно растворимая в водных растворах, особенно при , т.е. в области максимальной активности многих

0

синтеза; наличие ЗОзН-группы, увелипротеаз, в том числе протеаз крови, а в качестве субстратов для определения активности ферментов соответственно используют 1-(аминоацил)амино- нафталин-5-сульфокислоты (или их сои) . Дополнительными преимуществами 1-аминонафталин-5-сульфокисл6ты в качестве хромофорной группы ферментных субстратов являются интенсивная флюоресценция, что позволяет контролировать ход процесса на всех стадиях

синтеза; наличие ЗОзН-группы, увеличивающеи растворимость в водных растворах; способность к азосочетанию как в виде азо-, так и после предварительного диазотирования, диазоком- понент с образованием интенсивно окрашенных красителей и; доступность (1-аминонафталин-5-сульфокислота применяется в качестве исходного соединения при синтезе красителей, выпуск ее освоен промьшшенностью и проводится в значительных масштабах).

45 50

В результате отказа от использования канцерогенных веществ - производ- ньпс нафтиламина, обеспечивается воз- 55 можность производства субстратов для ферментного анализа промьшшенностью СССР (расширение возможностей производства) , отпадает необходимость ввоза субстратов из-за рубежа, улучшают313592534

ся условия труда персонала,В резуль- где R - остаток аминокислоты, ацилтате увеличения растворимости повышается максимально допустимая концентрация в пробе, что позволяет анализи- ровать ферменты с низким сродством к субстрату (расширение области исследования) , а также обеспечивает возможность анализа ферментов при низких температурах. Формула изобретения

1. Способ спектрометрического определения амидазной активности ферментов, предусматривающий проведение

3. Способ по п. 1, отлича щийся тем, что в качестве суб страта используют 1(тозилглицил-1ферментативной реакции гидролиза ами- ,5 пролш1-1-аргинил)аминонафталин-5иоацильного производного соединения нафталинового ряда с регистрацией изменения поглощения света, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, в ка- JQ честве субстрата фермента используют 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфо кислоты общей формулы: RNH

сульфокислоту или ее соль.

4.Способ по п. 1, отлича щийся тем, что продукт реакци определяют спектрофотометрически при -Л 330 нм и в том же раств ре, где проводилась ферментативная реакция,

5,Применение 1-аминонафталин-5 25 сульфокислоты в качестве детектиру мой группы субстратов ферментов, о ладающих амидазной активностью.

аминокислоты или пептида, или их соли.

отличаю2. Способ по п. 1,

щ и и с я тем, что в качестве субстрата используют 1-(N -карбобензо- ксиаргинил)аминонафталин-5-сульфо- кислоту или ее соль.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют 1(тозилглицил-1пролш1-1-аргинил)аминонафталин-5сульфокислоту или ее соль.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что продукт реакции определяют спектрофотометрически при -Л 330 нм и в том же растворе, где проводилась ферментативная реакция,

5,Применение 1-аминонафталин-5- сульфокислоты в качестве детектируемой группы субстратов ферментов, обладающих амидазной активностью.

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способам анализа ферментов, гидроли- зующих амидные связи. Изобретение может быть использовано в пищевой, фото-, микробиологической промьпплен- ности, медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является ускорение и упрощение процесса. Для определения амидазной ферментативной активности с помощью 1-(аминоацил)амино- нафталин-5-сульфокислот последние вводят в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, оптимальней для исследуемого фермента, другие компоненты, необходимые для проявления ферментативной активности (меркапто- этанол, комплексоны, неорганические ионы и др.), смесь термостатируют, добавляют фермент и измеряют изменение оптической плотности либо в области поглощения продукта ( нм), либо в области поглощения субстрата ч ( нм) . Первое предпочтительно, так как другие соединения, обычно находящиеся в смеси, в этой области не поглощают. 1-(аминоацш1)аминонафта- лин-5-сульфокислота (АА) под действием фермента отщепляет 1-аминонафта- лин-5-сульфокислоту (АНСК): RTS1H 2 (О1О) ROH+ За ходом реакции наблюдают в УФ по убыли поглощения АА (280 нм) или приросту АНСК (330 нм). Е-трипсин, тромбин, папаин, проназа К-лейцил,то- зилглицилпролиларгинил, карбобензо- ксиаргинило 2 с, и 3 з.п. ф-лы, 2 табЛо с (Л

Трипсин 1-Тозш1Глицил-1-пролил-1аргинил)аминонафталин-5- сульфокислота

Тромбин То же

Папаин 1-(1-N -карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5- сульфокислота

Тромбин То же

Т а б л и ц а 1

По примеру 1 10 25

2 37

10 25

30 37

Таблица2

ПоказательСпособ

Прототип Предлагаемый Время инкубации2 ч 2-30 мин

ДиазольЕсть Нет

Стадия экстракции этил- ацетатомЕсть Нет

Стадия центрифугирования Есть Нет Операции переноса3 О

Т а -б л и ц а 3

ПоказательПо прототипу Детектируемая группа

КанцерогенностьЕсть Нет

ДоступностьПроизводство Производится

в СССР за- в СССР прещено

Способность образовьшать

водорастворимый краситель

в реакции азосочетания Нет Есть

Составитель Л.Борисова Редактор Н.Горват Техред М.Ходанич Корректор А,Обручар

Заказ 6109/23 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 1