ПРОИЗВОДНЫЕ L-АРГИНИЛАМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФАМИДОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ СИНТЕЗА 1-АМИНОАЦИЛАМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФАМИДОВ И 1-АМИНОАЦИЛАМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФАМИДЫ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО РЕАГЕНТА ДЛЯ АНАЛИЗА ФЕРМЕНТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Советский патент 1995 года по МПК C07K1/10 C07K5/04 

Изобретение относится к новым соединениям: производным L-аргиниламинонафталин-5-сульфамидов в качестве промежуточных продуктов для синтеза 1-аминоациламинонафталин-5-сульфамидов и к 1-аминоациламинонафталин-5-сульфамидам в качестве флуоресцирующего реагента для анализа ферментов обладающих амидазной активностью, которые могут найти применение в микробиологии, медицине.

Цель изобретения новые производные аминокислот и пептидов, обладающие амидазной активностью, с более высокой чувствительностью.

П р и м е р 1. 1-(N-карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-(N,N-пентаметилен) сульфамид.

Раствор 3,5 г (10 ммоль) N-карбобензокси-L-аргинина гидрохлорида в 20 мл диметилформамида приливают при охлаждении до -4^оС и перемешивании к раствору 1,33 г оксибензотриазола в 10 мл диметилформамида, добавляют 2,1 г дициклогексилкарбодиимида и перемешивают 40 мин при 0^оС. К полученному раствору добавляют 3,7 г (10 ммоль) бромгидрата 1-аминонафталин-5-(N,N-пентаметилен)сульфамида и 2,8 мл триэтиламина. Смесь перемешивают 48 ч. осадок отделяют фильтрованием, к раствору добавляют 60 мл этилацетата и 120 мл гексана. Жидкость декантируют, осадок промывают смесью гексан-этилацетат, растворяют в смеси бутанол вода. Бутанольный слой отделяют, водный экстрагируют бутанолом, объединенные бутанольные вытяжки промывают 5% водным NaHCO₃, 5% водным КНSO₄, водой и упаривают досуха. Полученный сырой 1(N-карбобензокси(-аргиниламинонафталин-5-(N,N-пентаметилен) сульфамид (Rf=0,75. Силуфол, бутанол 4, уксусная кислота 1, вода 2) без кристаллизации вводят в следующую стадию синтеза.

П р и м е р 2. 1-L-аргиниламинонафталин-5-(N,N-пентаметилен)сульфамид.

4 г 1-(N-карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-(N,N-пентаметилен) сульфамида, полученного, как описано в примере 1, заливают 40 мл 2 н. НВr в уксусной кислоте, перемешивают 2,5 ч при 20^оС, выливают при перемешивании в 600 мл эфира, осадок фильтруют, растворяют в 200 мл воды, экстрагируют этилацетатом, водный слой упаривают досуха, наносят на колонку 15х5 см с силикагелем и элюируют смесью бутанол-4, уксусная кислота 1, вода 2. Зону с голубой флюоресценцией собирают, упаривают досуха, растворяют в воде, нагревают с 0,5 г активированного угля, фильтруют, добавляют 1 г NaBr, упаривают до 20 мл, подщелачивают до рН 7,8 с помощью Na₂CO₃. Осадок отделяют, сушат в вакууме. Выход 2,1 г (40%), 0,28 (Силуфол, бутанол 4, уксусная кислота 1, вода 2), 0,18 (Силуфол, изопропанол 7,8% NH₄OH 3), на хроматограммах проявляют нингидрином, обладает синей флюоресценцией (400 нм), УФ 288 нм.

П р и м е р 3. Тозилглицил-L-пролил-L-аргиниламинонафталин-5-(N,N-пентамети- лен)сульфамид.

К раствору 330 мг тозилглицил-L-пролина в 5 мл диметилформамида добавляют 140 мг оксибензотриазола, охлаждают до -4^оС, добавляют 250 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 30 мин, добавляют 530 мг гидробромида 1-(L-аргиниламино)-нафталин-5-(N,N-пентаметилен) сульфамида и 140 мкл триэтиламина, перемешивают 24 ч при 4^оС и 24 ч при 20^оС, фильтруют, упаривают в вакууме досуха, наносят на колонку 12х5 см с силикагелем, элюируют, как в примере 2, зону с голубой флюоресценцией собирают, упаривают досуха. Получают 730 мг (85) гомогенного по ТСХ тозилглицил-L-пролил-L-аргиниламинонафталин-5 (N,N-пентаметилен)сульфамида в виде аморфного порошка, УФ=289 нм.

Аналогичным образом могут быть получены другие 1-аминоацил)-аминонафталин-5-сульфамиды.

П р и м е р 4. Анализ субстратов и продуктов ферментативного гидролиза и определение активности фермента методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

К 1 мл 1 мМ раствора тозилглицил-L-пролил-L-аргиниламинонафталин -5-(N, N-пентаметилен)сульфамида в 0,1 М трис-НСl буфере рН 8,2 добавляют раствор 10 мкг трипсина в 50 мкл того же буфера, перемешивают и инкубируют при 25^оС. Аликвоты по 50 мкл отбирают в фиксированные промежутки времени, разделяют в режиме обращенно-фазовой хроматографии на колонке Zorbax C8 (250х4,6 мм) с градиентной элюцией при скорости потока 1,5 мл/мин и температуре 35^оС. При завершении ферментативной реакции пик исходного субстрата полностью (>99) исчез, одновременно появились пики продуктов ферментативного гидролиза (времена удерживания 14,0 мин, 3,5 мин, 12,5 мин, соответственно). Идентификация пиков была проведена сравнением с заведомыми образцами 1-аминонафталин-5-(N,N-пентаметилен)сульфамида и тозилглицил-L-пропил-L-аргинина (последний получен ферментативным гидролизом тозилглицил-L-пролил-L-аргинил аминонафталин-5-сульфокислоты по вышеописанной процедуре). Скорости ферментативных реакций определяют по накоплению продукта (УФ-детектор, λ225 нм), причем скорость гидролиза аминоацилсульфамида была в 2,7 раза выше.

П р и м е р 5. Анализ субстратов и продуктов ферментативного гидролиза методом тонкослойной хроматографии.

Образцы, подготовленные и инкубировавшиеся, как в примере 4, разделяют тонкослойной хроматографией на пластинках с тонким слоем силикагеля, обнаруживают по флюоресценции при облучении ультрафиолетом, идентифицируют сравнением с заведомыми образцами. В системе бутанол-4, уксусная кислота -1, вода -2, Rf= соответственно, 0,39; 0,78. 0,31 для субстрата, хромофорной группы и пептида. Аналогичным образом анализируют другие пептиды.

П р и м е р 6. Определение амидазной активности трипсина с использованием аминоациламинонафталин-5-сульфамидов.

В кювету спектрофотомера помещают 0,5 мл 1 мМ раствора субстрата, как в примере 4, термостатируют при 37^оС, добавляют 10 мкл исследуемого образца фермента, перемешивают и по скорости уменьшения поглощения при 300 нм определяют активность фермента. Аналогичным образом может быть определена амидазная активность различных ферментов. Поскольку характер операций при этом не меняется, примеры собраны в табл. 1.

Проведенные испытания показали, что 1-аминоациламинонафталин-5-сульфамиды обладают более высокой активностью как субстраты амидаз, чем известный субстрат: 1-(карбобензоксиаргинил) аминонафталин-5-сульфокислота (см. табл. 2).

Изобретение касается производных аминокислот, в частности производных L аргиниламинонафталин -5- сульфамидов - промежуточных продуктов для синтеза соответствующих 1-аминоациламинонафталин -5- сульфамидов, которые могут быть использованы в качестве флуоресцирующего реагента для анализа ферментов, обладающих амидазной активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых замещенных аминокислот и пептидов с повышенной активностью. Синтез промежуточных веществ общей ф-лы:где А= a) Cbz-Arg; б/Arg; S(O)₂-NH-(CH₂)₃-CH₃ ведут, например добавлением гидрохлорида N- карбобензокси L-аргинина в диметилформамиде при (-4)°С к такому же раствору оксибензотриазола с последующим введением дициклогексилкарбодиимида при 0°С, добавлением бромгидрата 1-аминонафталин-5-(N, N-пентаметилен) сульфамида и триэтиламина (все протекает при перемешивании). Затем выделенный продукт заливают НВr в уксусной кислоте и перемешивают при 20°С, осаждают эфиром, отделяют осадок, растворяют на силикагеле с элюированием смесью бутанола, уксусной кислоты и воды (4:2:2) с выделением при этом зоны с голубой флуоресценцией. После пептидного синтеза за счет наращивания получают соединения общей ф-лы: где Х имеет указанные значения а= Tos-Gly-Pro-Arg, (L-форма). Испытания этих веществ для анализа субстратов и продуктов ферментативного гидролиза показывают, что скорость гидролиза указанных сульфамидов возрастает в 2,7 раза. 2 табл.

1. Производные l-аргиниламинонафталин-5-сульфамидов формулы 1

где a CbZ-Arg; Arg:



SO₂NH(CH₂)₃CH₃,
в качестве промежуточных продуктов для синтеза 1-аминоациламинонафталин-5-сульфамидов. 2. 1-Аминоациламинонафталин-5-сульфамиды формулы II

где A=ToS-Gly-Pro-Arg(L-форма);



SO₂NH(CH₂)₃CH₃,
в качестве флуоресцирующего реагента для анализа ферментов, обладающих амидазной активностью.