1-АМИНОНАФТАЛИН-5-СУЛЬФАМИДЫ В КАЧЕСТВЕ ДЕТЕКТИРУЕМЫХ ГРУПП ДЛЯ АНАЛИЗА СМЕСЕЙ ПРОТЕАЗ Советский патент 1994 года по МПК C07C311/15 

Изобретение относится к производным аминонафталинсульфокислот, конкретно к новым 1-аминонафталин-5-сульфамидам общей формулы I -N (Ib) где Х - NHC₂H₅ (Ia); N(CH₃)₂ (Iб), в качестве детектируемых групп для анализа смесей протеаз, которые могут найти применение в биохимии.

Цель изобретения - выявление в ряду производных аминонафталинсульфокислот новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве детектируемых групп для анализа смесей протеаз проводить анализ многокомпонентных смесей протеаз за счет селективно отщепляемых детектируемых групп.

Изобретение иллюстрируется примерами.

П р и м е р 1. Триэтиламмонийаминонафталин-5-сульфонат.

К суспензии 68 г (0,30 моль) аминонафталинсульфокислоты в 100 мл воды прибавляют 44 мл (0,32 моль) триэтиламина, нагревают до растворения, горячим фильтруют с углем и инфузорной землей. По охлаждении кристаллы отделяют фильтрованием, сушат на воздухе. Выход 94 г (96% ). Перекристаллизовывают из водного изопропанола, т. пл. 197^оС. Из-за значительного давления пара амина над веществом при нагревании анализируется в виде трифторацетильного производного.

П р и м е р 2. 1-Трифторацетиламинонафталин-5-сульфонат триэтиламмония.

К суспензии 13 г (0,04 моль) триэтиламмониевой соли 1-аминонафталин-5-сульфокислоты в 80 мл сухого эфира при перемешивании с обратным холодильником прибавляют 33.6 г (четырехкратный избыток) трифторуксусного ангидрида в 15 мл эфира. После прекращения кипения эфира раствор дополнительно кипятят 3 ч, оставляют на 12 ч при 20^оС. Осадок фильтруют, промывают эфиром при растирании, сушат в вакууме. Получают 16 г (95% ) аналитически чистого продукта. Кристаллы растворимы в воде, разлагаются при температуре выше 200^оС; УФ: 289 нм; R_f 0,57 (силуфол; бутанол 4, уксусная кислота 1, вода 2); растворы не обладают заметной флюоресценцией при УФ-облучении.

Вычислено, % : С 51,42; Н 5,19; S 7,63; N 6,66.

C₁₈H₂₃F₃N₂O₄S.

Найдено, % : С 51,60; Н 5,19; S 7,59; N 7,09.

Аналогично проводят реакцию в трифторуксусной кислоте (6 ч, 45-50^оС), упаривают досуха, переупаривают с бензолом, остаток промывают эфиром, сушат в вакууме. Выход 99% .

П р и м е р 3. 1-Трифторацетиламинонафталин-5-сульфохлорид.

К суспензии 9,6 г 1-трифторацетиламинонафталин-5-сульфоната триэтиламмония в 80 мл CHCl₃ прибавляют 6,5 г PCl₅, перемешивают при 50^оС 12 ч, охлаждают, фильтруют, к фильтрату добавляют 500 мл гексана и оставляют при -10^оС на 12 ч. Осадок отделяют фильтрованием и перекристаллизовывают из смеси CHCl₃ - гексан. Получают 3,6 г аналитически чистого продукта. Дополнительные количества вещества выделяют обработкой маточных растворов. Общий выход 7,65 г (90% ), т. пл. 163^оС (из CHCl₃, неисправл. ), R_f 0,6 (силуфол; этилацетат: гексан, 2: 1).

Вычислено, % : C 42,68; H 2,09; Cl 10,65; F 16,86; N 4,15.

C₁₂H₇ClF₃NO₃S.

Найдено, % : C 42,96; H 2,32; Cl 10,51; F 16,45; N 4,52.

П р и м е р 4. 1-Аминонафталин-5-сульфамид.

6,7 г 1-трифторацетиламинонафталин-5-сульфохлорида суспендируют в 40 мл 25% -ного водного раствора NH₄OH. 6 ч при 37^оС, упаривают до 20 мл, экстрагируют этилацетатом, упаривают досуха, кристаллизуют из водного этанола, получают 4 г 1-аминонафталин-5-сульфамида.

Другие примеры получения приведены в табл. 1 и 2.

Применение получаемых аминонафталинсульфамидов (АНСА) для анализа смесей протеаз в варианте с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) иллюстрируется следующим.

АНСА-анализ - новый метод анализа смесей протеаз, в т. ч. близкой специфичности. Метод состоит в использовании в одном анализе смеси нескольких субстратов с определением продуктов протеолиза каждого из них.

Для реализации метода в варианте с применением хроматографии предложены хромогенные субстраты с аминонафталинсульфамидными (АНСА) детектируемыми группами. Возможность раздельного определения продуктов протеолиза каждого из субстратов обеспечивается различием в строении заместителей, связанных с детектируемой АНСА-группой.

Схема метода АНСА-анализа: > >
Метод применяют также для характеристики индивидуальных протеаз и их смесей. Каждой протеазе может быть противопоставлен "АНСА-спектр" - набор чисел, характеризующий отношение кинетических констант расщепления серии субстратов. Информативность метода быстро (≈n²) растет с ростом числа субстратов в серии. Для рутинных исследований (без использования ЭВМ) протеазу можно характеризовать отношением кинетических констант расщепления двух субстратов, выбранным из всего множества подобных отношений по принципу максимального отклонения от средних для нескольких протеаз значений. Ниже приводится пример получения таких отношений с известными и новыми АНСА.

К раствору 3.5 г карбобензоксиаргинина в 20 мл диметилформамида приливают при -10^оС полученный при -30^оС и выдержанный при 20^оС в течение 40 мин раствор 1 мл SOCl₂ в 10 мл диметилформамида, перемешивают 30 мин при 4^оС, охлаждают до -20^оС, добавляют раствор смеси аминонафталин-5-сульфамидов в 10 мл диметилформамида (по 1 ммоль каждого из пяти или эквимолярные количества каждого из серии, в сумме 5 ммоль). Вливают 1,5 мл триэтиламина, перемешивают 4 ч при 4^оС и 12 ч при 20^оС, добавляют триэтиламин до слабощелочной реакции, приливают 150 мл этилацетата и 200 мл гексана, осадок промывают смесью этилацетат - гексан, растворяют в смеси бутанол-вода, верхний слой отделяют, водный экстрагируют бутанолом. Бутанольные вытяжки промывают 5% -ным NaHCO₃, 10% -ным KHSO₄, упаривают досуха, заливают 40 мл 2,5 М HBr в СН₃COOH, через 1,5 ч добавляют 600 мл диэтилового эфира, осадок растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом. Водный слой подщелачивают NaOH до рН 7,5, экстрагируют бутанолом, упаривают, растворяют в воде до концентрации 300 О. Е. λ = 300/мл, экстрагируют смесью этилацетат 4, гексан 1, экстракт отбрасывают. Водный слой упаривают в вакууме до удаления этилацетата и используют для приготовления субстратных смесей, растворяют аликвоту в буферном растворе (например, 0,05 М трис-HCl+0,005 М дитиотрента, рН 7,4) и разбавляя водой до концентрации 7,0 Е. λ = 300/мл. Добавляют один из не использованных для приготовления субстратной смеси АНСА в качестве внутреннего стандарта до концентрации 0,1 О. Е. λ = 350/мл. Аликвоту 0,5 мл помещают в кювету спектрофотометра, термостатируют, добавляют 10 мкл исследуемого фермента, регистрируют изменение поглощения λ = 360 нм во времени, по возрастании поглощения вдвое от первоначального останавливают реакции добавлением, например, ингибитора протеаз данного класса. Смесь экстрагируют 0,5 мл этилацетата, экстракт упаривают, остаток растворяют в 30 мкл 38% -ного ацетонитрила с добавкой 0,1 М ацетата аммония, анализируют ВЭЖХ с элюцией тем же раствором, интегрированием пиков определяют количества образовавшихся АНСА. (Колонка с 18 250х4,6 мм, 40, 1 мл/мин, УФ-детектор- λ = 265 нм). При определении относительных величин используют высоты пиков при графической регистрации хроматограммы.

Примеры получаемых результатов.

Сравнение индексов предпочтительности для папаина (П) и
микросомной Sigma) (Л) с известными АНСА: для
P_=1,16 для
ЛРP_=0,88 oтношение 1,31. С новыми АНСА: для
ПР _N< P = 0,64 для
ЛР _N< P = 0,33 отношение 1,93 (значительное отличие от 1 в сравнении с незначительным в первом Индексы для протеазы Sigma 4630: c известными:
РP_=1,33 с новым:
РP_=2,15 (при переходе к гомологу резкое улучшение кинетических констант).

Таким образом, использование 1-аминонафталин-5-сульфамидов в качестве детектируемых групп для анализа смесей протеаз позволяет проводить количественный анализ сложных смесей протеаз без их разделения и однозначно охарактеризовать каждую из протеаз соответствующим набором индексов селективности, что невозможно приводить с использованием известных соединений. (56) Авторское свидетельство СССР N 1419108, кл. С 07 С 143/80, 1986.

Изобретение относится к сульфамидам ароматических аминосульфокислот, в частности к 1-аминонафталин-5-сульфамидам ф-лы , где X-NHC₂H₅ (Ia), N(CH₃)₂ (Iб), NC₆H₁₂ (Iв), в качестве детектируемых групп для анализа смесей протеаз. Цель - выявление соединений, позволяющих проводить анализ многокомпонентных смесей протеаз за счет селективно отщепляемых детектируемых групп. Получение ведут из 1-трифторацетиламинонафталин-5-сульфохлорида и водного раствора NH₇OH с последующей экстракцией этилацетатом или ацетоном. Выход, % , Т. пл. , С; брутто ф-ла: для соединения 1а - 90; 172; C₁₂H₁₅BrN₂O₂S; для 1б - 83; 125 - 127; C₁₂H₁₄N₂O₂S; для 1в - 86; 164 - 166; C₁₆H₂BrN₂O₂S. 2 табл.

1-Аминонафталин-5-сульфамиды общей формулы
N
где X - NHC₂H₅, N(CH₃)₂,
в качестве детектируемых групп для анализа смесей протеаз.