1
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи.
Цель изобретения - повышение чувс твительности способа.
Способ заключается в расщеплении под действием определяемого фермента аминоациламино-нафталинсульфамидов и спектрометрическом определении образующихся амино-нафталинсульфами- дов цветной реакцией с солями арил- диазония, например 4-сульфофенилдиа- зония или 4-нитрофенилдиазония.
Для определения амидазной активности ферментов по предлагаемому спо собу к термостатированному водному раствору субстрата-1-(аминоацил)- -аминонафталин-5-сульфамида, содержа щему компоненты, необходимые для нор мального функционирования фермента (например, соли, поддерживающие оптимальное значение рН), добавляют известное количество препарата .фв мен- та. Полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония, и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность, предпочтительно, в максимуме поглощения красителя, используя в качестве раствора сравнения аналогичный по составу раствор, в который ферме1 т бьш добавлен лишь . после добавления проявителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом.
Пример 1. Определение активности трипсина с использованием ,1-(М-карбобензоксиаргинил)-аминонаф- талин-5-(н , N -пентаметилен)-сульфамида.
Готовят следующие рабочие растворы.
Раствор 1. 1мм 1-(Ы-карбобензокси- аргинш1)-аминонафталин-5- N , N-пентаS
10
15
20
538092
метиленсульфамида в 0,1 М трис- -НСТ1 буфере рН 7,8.
Раствор 2. 1 мМ борфторида Ffитpo- фенилдиазония в 0,9 М уксусной кислоте.
К 1 мл термостатированного при 25 С раствора 1 добавляют 10 мкл раствора фермента, перемешивают вСтря- .хиванием, инкубируют 20 мин, добавляют 1 мл раствора 2, через 5 мин определяют оптическую плотность при 500 нм, используя в качестве раствора сравнения инкубировавшуюся смесь 1 мл раствора 1 и 1 мл раствора 2, в которую фермент добавляют после приготовления смеси. Содержание фермента определяют из отношения оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов.
Аналогичным образом могут быть определены амидазные активности других ферментов.
Результаты опытов приведены в таблице.
Использование изобретения позволит повысить чувствительность определения амидазной активности ферментов, что особенно важно при проведении 30 клинико-лабораторных исследований.
Формула изобретения
Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью,
og предусматривающий проведение ферментативной реакции гидролиза амино- ацильного производного соединения нафталинового ряда, азосочетание продукта реакции с солью диазония
40 с последую15 ей регистрацией поглощения света, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстратов ферментов используют 1-(ами4g ноацил)-аминонафталин-5-сульфамиды общей формулы
25
где R X
-аминоацил, ациламиноацил, пентидил;
-сульфамидная труппа.
1Л CM
л PJ
о
о s а н
ем Е
со
1Л
о а: а о
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Пель - повъшение чувствительности способа определения. Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному водному раствору субстрата - 1 -(аминоацил)- -аминонафталин-5-сульфамида добавляют известное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного.интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность в максимуме поглощения красителя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта «реакции и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом. 1 табл. (Л со ел ОО 00
