Способ получения иммобилизованной аминоацилазы Советский патент 1983 года по МПК C12N11/14 C12N9/78 

«

(Л

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ АМИНОАЦИЛАЗЫ, включающий. ковалентное связывание фермента с активированным силохромом, о т л иi4 а ю m и и G- я тем, что, с целью повышения стабильности иммобилизованного фермента, полученный продукт дополнительно обрабатывают водным раствором глиоксаля в соотношении 0,01-0,15 г глиоксаля на ,1 г препарата.

О5

о о |

о

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения препаратов иммобилизованных ферментов, которые используются в качестве гетерогенных катализаторов для трансфррмации органических соединений.

. Известно большое количество способов иммобилизации аминоацилазы и, в т.ч.на неорганических носителях, например, путем ковалентного связывания с модифицированным j -аминопропилтриэ оксисиланом и п -нитробензоилхлоридом монтиориллионитом.

Недостатком способа является низкая активйость иммобилизованного фермента и невысокая стабильность препарата. .

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения иммобилизованной аминоацилазы, включающий ковалентное связывание фермента с актив рованным силохромом. Активирование силохрома включает обработку аминопропилтриэтоксисиланом и последующу активацию ti -бензохиноном. Характеристика препарата водонерастворимой аминоацилазы: содержание белка 47,85 мг/0,5 г носителяj ацилазная активность - 31,8 мкмоль ь-метионина в минуту (0,5 г носителя), определенная в кинетической области стабильность - при непрерывном пропускании субстрата (раствора N-ацетил-D,L-аминокислоты), катализатор сохраняет активность в течение 116 (для к-ацетил-В,Ь-метионина) до 1110 ч (для И-адетил-С,L-серина).

.Цель изобретения - повышение стабильности иммобилизованной аминоациазы .

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной аминоацилазы,включающему ковалентное связывание фермента с активированным силохромом, полученный продукт дополнительно об .рабатывают водным раствором глиоксаля в соотношении 0,01-0,15 г глиоксаля на 1 г препарата.

Аминоацилаза является (ферментом, состоящим из двух субъединиц, и процесс ее денатурации происходит в две стадии. На первой стадии происходит диссоциация фермента на субъединицы, причем на этой стадии теряется большенство исходнЪй активности фермента. На второй стадии происходит денатурация отдельных мономеров. Скрепление четвертичной структуры ацилазы бифункци ональными реагентами, глиоксалем исключает диссоци&цию ацилазы и обеспечивает длительное сохранение каталитической актир-ности фермента (до 21о6 ч), С этой целью препараты

иммобилизованной аминоацилазы после ковалентной иммобилизации на активированных силохромах обрабатывают водным раствором глиоксаля в весовых соотношениях 1:0,01-0,15.

Пример l.Klr силохрома обработанного у-аминопропилтриэтоксисиланом, прибавляют раствор 0,2 г п-бензохинона в 60 мл 70%-но го изрпропилового спирта, выдерживают при комнатной температуре 1 ч отфильтровывают, промывают 3-40 мл изопропилового спирта и 40 мл фос.фатного буфера с рН 7,2.

К активированному носителю прибавляют 4 мл буферного (фосфатный буфер с рН 7,2) экстракта ацетонового порошка свиных почек с ацилазной активностью 6900 мкмоль/г в мл и выдерживают при комнатной.температуре. Отфильтровывают и промывают 2-50 мл 1 М хлористого натрия и 50 мл фосфатного буфера с рН 7,2

К иммобилизованной аминоацилазе приливают 2 мл раствора глиоксаля (50 мг в 10 мл фосфатного буфера рН 7,2) и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Промывают 3 50 мл фосфатного буфера рН 7,2.

Получают препарат иммобилизованной аминойцилазы С: ацилазной акт.ивностью 3200 мкмоль/ч на г (определена в кинетических условиях).

Помещают 1 г препарата иммобилизованной аминоацилазы в термостатируемую колонку (37-40°С) и nponydкают через нее -непрерывно 24,5 л 0,5 М раствора Ы-ацетил-В,ь-метионина со скоростью 11,6 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раствора L-метионина в элюате) в течение 2100 ч. Из элюата обычным способом выделяют L-метионин. Выход L-метионина 822, 5 г (89%) WJ д, 22, 8 (с 1,5 и. HCI). . ..: . П р и М е р 2. к 1 г силохрома

обработанного V -аминопропилтриэтокеисиланом, прибавляют раствор 0,04 г активированного носителя ярко-голубого КХ в 15 млдиметилформамида и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Продукт отфильтровывают, промывают 3-50 мл водой и 1 50 мл фосфатным буфером рН 7,2.

К активированному носителю прибавляют 2 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек в 0,1 н. фосфатном буфере с ацилазной активностью 6500 мкмоль/ч в мл, выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают, промывают 2-50 мл 1 М раствора хлористого . натрия и 50 мл фосфатного буфера с рН 7,2.

К препарату иммобилизованной аминоацилазы приливают 2 мл раствора глиоксаля (500 мг в 10 мл фосфатного буфера) и выдерживают 1ч при комнатной температуре. Промывают 350 мл фосфатного буфера рН 7,2. Получают препарат иммобилизованной аминоацилазы с ацилазной активностью 1000 мкмоль/ч на г (определена в кинетических условиях) . . Помещают 1 г препарата иммобилизованной аминоацилазы в гермостати ру емую ко л онк у (3 7 - 4 О с) и пропус кают через нее непрерывно 4,55 л 0,5 М раствора Н-ацетил-В,Ь-метионина со скоростью 0,32 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раст вора L-метионина в элюате) в течение 1420 ч. Из элюата обычным способом вы-деляют L-метионин. Выход L-метиони на 149,3 г (88%). otl,, 23° (с 1,. 5 н. НС1). Пример 3. 0,25 г м-фениле диамина растворяют в 10 м:; 1 М соляной кислоты. К раствору добавляю 1 г силохрома С-80. Смесь охлаждаю до О-2с и постепенно приливают . 10 мл 2%-ного раствора азотистокис лого натрия в течение 0,5 ч. Смесь отфильтровывают, промывают водой до полного удаления окраски в про мьшных водах, промывают 50 мл 0,1 М раствора фосфатного буфера-с рН 7,2. К активированному носителю прибавляют 2 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек с ацилазлой активностью 6520 мкмоль/ч в мл и выдерживают 2 ч при -9°С, Отфильт ровывают, промывают мл 1 М раствором хлористого натрия и 50 м фосфатного буфера. к препарату иммобилизованной ацилазы приливают 2 мл раствора гли оксаля (750 мг в 10 мл фосфатного буфера) и выдерживают 1 ч при комнатной температуре. Промывают мл фосфатного буфера с рН 7,2. Получают препарат иммобилизованной аминоацилазы с ацилазной активностью 2500 мкмоль/ч на г (определена в кинетических условиях). Помещают 1 г препарата иммобилизованной аминоацилазы в термостатируемую колонку (37-40С) и пропускают через нее 17,2 п 0,5 М раствора Н-ацетил-D,L-метионина со скоростью 9 мл/ч (обеспечивающей образование 0,25 М раствора L-метио Нина в элюате) в течение 1950 ч. Из элюата обычным способом выделяют L-метионин. Выход Ь-метионина 546,5 г (88%). 22,7 (с 1,5 н. HCI). Технико-экономический эффект изобретения заключается в стабилизации иммобилизованных препаратов аминоацилазы и применение стабилизированных препаратов иммобилизованной аминоацилазы в качестве гетерогенного биокатализатора для получения оптически активных аминокислот, что позволяем применять биокатализатор более длительное время,а в.связи с этим увеличивается выход оптически активной аминокислоты, например, метионина, на 1 г катализатора с .49,24 до 822,5 г. Каталитическая активность иммобилизованной аминоацилазы сохраняется в течение 1420-2100. ч по сравнению со 116 ч по прототипу (при использовании в качестве субстрата Н-ацетил-в,L-метионина). Таким образом, стабильность ферментного препарата возрастает в 12-18 раз.