113
Изобретение относится к способу получения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов - биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине .
Цель изобретения - способ получения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов, обладающих иммуногенной активностью с низкой пирог енностью.
Синтез (LH-RH)-MTP. 3 мг LH-RH, взятого в кислой форме, добавляют к 242 мг хлоргидрата М-э1ил-М -(З-метиламинпропил)-карбо- диимида (ECD l) и к 43 мг 1-окси- бензотриазола (НОВТ), используя в качестве среды 0,4 мл диметилформа- мида (DMF).Инкубацию проводят при магнитном перемешивании в течение 7 ч при температуре окружающей среды Затем к этому раствору прибавляют 3,24 мг МТР (М-ацетилмурамш1-1-ала- нил-0-изоглютаминил-1-лизин),смешанного с 0,3 мл дистиллированной воды, и оставляют полученную смесь для продолжения реакции при магнитном перемешивании в течение 48 ч при температуре окружающей среды. Продукты реакции растворяют в 0,15 М растворе NaCl и рекуперируют образовавшиеся сопряженные соединения путем фракционирования через молекулярное сито Sephadex G 10. Сопряженные соединения вымывают в мертвом объеме. Определяют содержание пептидов в мураминовой кислоте. Обнаружено, что 93% МТР вступило в реакцию сочетания: число молекул МТР относится к числу молекул LH-RH, как примерно 1:1.
Синтез сопряженного соединения МТР - тетанический (столбнячный) токсин (вьтолнен в качестве сравнительного примера).
Смешивают 16 мг МТР, 0,15 мл DMF, более 0,0 мл PBS с рН 7,4 (соляной раствор, тампонированный фосфатом), затем 300 г ECD 1, 1 мг НОВТ и 2 мг раствора тетанического токсина. Смесь оставляют для протекания реакции на 15 мин при магнитном перемешивании и при температуре окружающей среды в темноте. Затем прибавляют к этой смеси 300 г ECD1 , 1 мг НОВТ и 2 мг тетанического токсина; реакция идет еще в течение 15 мин. Эту операцию повторяют 9 раз. Затем
32
констатируют, что 20 мг тетанического токсина было использовано. По окончании реакции рекуперируют сопряженное соединение путем хроматог- рафии на колонке Sephadex G75 в PBS. Сопряженное соединение содержится в верхней точке промывки. Соответствующие определения тетанического токсина
и МТР осуществлялись по методике Fo- 1 i п и Re i SS i g .
Иммунизация LH-RH,соединенным с мурамилпептидом и введенным в соляной раствор или добавку (FIA).
На 1,2,4 и 29-й день вводят подкожно 0,1 мл следующего раствора группе мьш1ей-самцов Swiss, имеющим возраст 6 недель:
1)50 г LH-RH, эмульгированно- го в добавке complet de Freund;
2)50 fj.r LH-RH, эмульгированного в FIA;
3)8,ft рг LH-RH, сопряженного с 4,3 ft г MDP и эмульгированного в
FIA;
4)50 LH-RH в PBS;
5)8,6 г LH-RH, сопряженного с 4,3 f г MDP в PBS.
Трем дополнительным группам мышей, взятых для сравнения, вводят аналогично либо РСА,либо FiA, либо РВ$,не содержащие ни антигена, ни MDP.
Перед использ-ованием антиген
(LH-RH чистый или подвергнутый сочетанию ) был адсорбирован на 50%-ном РУР (поливинилпирролидоне ) в 0,9% NaCl, а инкубация осуществлялась в течение 2 ч; затем смесь подвергали
эмульгированию с FIA или FCA, ипи добавлялись к PBS.
0,1 мл соединения, содержащего 12,5%-ный РУР, вводили подкожно мышам .
На 23 и 50-й день все мьшзи были здоровы, их умерщвлили, а их сыворотку собрали и объединили по группам. Семенники мышей и семенные пузырьки анализировались, взвешивались, после
чего их поместили в раствор Boin и приготовили для гистологического изучения.
Обнаружение антител анти-(LH-RH).
Антитела анти-,LH-RH) обнаруживают ледующим образом. Вводят 50 / л сыоротки, нерастворенной перед тестиованием, 50 л нормальной сьшорот- и зайца, растворенной на 1/80-ю в
PBS, и 10 л (LH-RH) .помеченного йодом 125 приблизительно 10 000 распадок в минуту: dpm). ИНкубация протекала в течение 72 ч при 4°С. Затем добавляли 150 р. и суспензии, охлаж- денной на льду, активного угля, покрытого декстраном ( полученной при добавлении 250 мг активного угля в I00 мл раствора декстрана в 0,01 М растворе PBS). Смесь оставляют при 4 С в течение 5 мин. После центрифугирования, осуществляемого при 2500 об/мин в течение 20 мин, ве- шество, оказавшееся на поверхности смеси, декантируют и определяют его радиоактивность по методу Хабер. Преварительное изучение показывает, что уголь, покрытый декстраном, может адсорбировать до 95%-ного (LH-RH) чистого в указанных условиях.
Обнаружение антител анти-МТР.
Контролируют присутствие антител анти-МТР с помощью гемолитического теста, осуществляемого на пластинах микродозирующих, имеющих углубления в виде у (Cooke Engenering), следующим образом: сьшоротку разрушают путем инактивации в течение 30 мин при 56°С. 50 )u л сьшоротки, прошедшей двойное разбавление, смешивают с 50 |ц. л PBS. Затем в смесь вводят 20 |U г сопряженного соединения свежие кровяные шарики-МТР, имеющего концентрацию 2,5%, оставляют смесь для инкубации на пластинах при 37°С в течение 15 мин: наконец вводят 20 л добавления нормальной сьшоротки морской свинки,разбавленной с PBS до соотнощения 1:20 и снова ос
тавляют эту смесь для инкубации при
37°С в течение 30 мин перед тем, как заметить результаты.
Оценка пирогенности.
Опыты осуществлялись на новозеландских кроликах весом от 2,5 до 2,8 кг. Значения температуры определялись с помощью зонда с термистором вводимого в прямую кищку кроликов на глубину примерно 8 см и соединенного с термометром модель № ТЕЗ, Ко- пенгаген, Дания . Кролики содержалис и наблюдались в климатической камере при 20°С. Инъекции вводились только тем животным, температура которых оставалась стабильной в течение предшествующих 30 мин. Значения температуры определялись в течение 3 ч после инжектирования композиции, пирогенность которой изучалась. Результаты выражались по среднему измене- нию температуры (С), полученному у кролика в течение 3 ч после внутривенного введения изучаемой композиции. Минимальная доза пирогенная соответствует количеству, вызывающему повышение температуры на ,
Опыты по иммунизации.
Результаты, указанные в табл.1, выражают отношение числа ударов в минуту (срм) поверхностного вещества к числу срм общему и умноженному на 100.
Т а б л и ц а 1
Обработка
I
Фиксация,%
LH-RH 50 г + FCA30,5
LH-RH 50 г + FIA2,5
LH-RH 50 кг + PBS10
(LH-RH)-MTP г + PBS63
0 5
0
При отсутствии антигена не замечают никакой фиксации в сьшоротке сравниваемых животных,получивших инъекцию FCA, FIA или PBS (измеренная фиксация) по максимуму 2,3% (не является показательной ). Однако антитела образовались, когда использовали эмульгированный в FCA 50 г (LH-RH) (30,5% фиксирования ). Не отмечают показательного результата в группе животных, получивших (LH-RH) в FIA (фиксация 2,5% , сла- бьм результат, полученный при использовании PBS (10%),не имеет смысла. Значительный результат получен при исследовании сыворотки, полученной от животных, иммунизированных сопряжением соединения MTP-(LH-RH), несмотря на то, что это соединение содержит только 8,6 |U г (LH-RH) и 4,4 fi г МТР. Действие антител даже повыщено, когда равное количество сопряженного соединения MTP-(LH-RH) введено в водной среде. Эти результаты указывают на то, что сопряженные соединения MTP-(LH-RH) являются оба более эффективными, чем соединение (LH-RH) с FCA, как и с FIA, так и с PBS.
Гистологический анализ.
Средний вес семенников несколько повысился (от 252 до 279 мг) в результате введения животным от 5 до 50 ,иг (LH-RH) в PBS. Хотя это повы- шение показательно (р 0,05), оно не связано с никаким гистологическим изменением. Наоборот то же количество антигенов, введенных в FCA, вызьшает существенное увеличение веса семен- НИКОВ при снижении выработки спермы и атрофии семенных каналов в некоторых случаях. И наоборот, у животных, получивших сопряженное соединение MTP-(LH-RH) взятое в растворе в PBS, вес семенников более низкий (р 0,01) чем у животных из других групп. Более того гистологический анализ семенников показал, что только в этой группе животных наблюдают атрофию, отметившую сразу интерстициальные клетки и семенные каналы, которые были практически лишены герминативных клеток, что отмечено у 9 мьшей из 10.
Определение антител анти-МТР.
Те же сыворотки объединили, что были использованы при определении активности к фиксированию.125 1 LH-RH также были изучены по содержа- нию антител анти-МТР с помощью гемолитического теста с сопряженными соединениями красных кровяных шариков и МТР. Сыворотка кролика аити-МТР, полученная после гипериммунизации, осуществленной с сопряженным соединением альфа-метиловый сложный эфир- МТР и сьшоротка альбуминная быка, использовалась в качестве сравнительного антигена. Тогда как конста-
тируя реакции гемолиза в сьшоротке анти-МТР кролика до конечного растворения 1:30.720, не отмечают никаких антител анти-МТР ни в одной группе животных, обработанных сопряженным соединением MTP-(LH-RH).
Обнаружение возможной пирогеннос- ти изучаемых сопряженных соединений со сравниваемыми молекулами.
Результаты, приведенные в табл.2, указьшают на отсутствие пирогенности у предлагаемых соединений по сравнению с пирогенностью либо самого му- рамилпептида, когда он находится в выделенном состоянии, либо сопряженного соединения, которое тот же мурамилпептид может образовать с естественным антигеном, например с те- таническим токсином. Сопряженное предлагаемое соединение t(LH-RH)-МТР не вызьюает значительного повьш1ения температуры у животного, даже когда относительная доза МТР в сопряженном соединении составляет примерно 9,3 ju г МТР. Эти результаты сравнимы с результатами, полученными в тех же условиях при использовании сравнительных сопряженных соединений (ТТ-МТР), вызьшающих значительное по вьш1ение температуры, даже когда относительное содержание МТР в сопряженном соединении, введенном животному, в 100 раз-ниже, чем количество предлагаемого соединения.
Кроме того, более высокие дозы сопряженного соединения (LH-RH)-MTP, включающего относительное количество в 77 jU г МТР, не вызьшает у животного отмеченного повьшения температуры.
Таблица 2
1,,6
3,4-1.8
17,,3
86 -46
86
Знак /- относится к сочетанию в исследуемых сопряженных соединениях между относительными дозами в этих сопряженных соединениях, с одной стороны,с гормоном, а с другой стороны, с МТР.
Полученные результаты свидетельствуют о низкой пирогенности полученного предлагаемым способом сопряженного соединения гаптена с мурамилпеп- тидом: LH-RH -М-ацетилмурамил-1- аланил-0-изоглютаминил-1-лизил.
Формула изобретения Способ получения сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов общей формулы: М-ацетилмурамил-1Составитель В.Волкова Редактор А.Долинич Техред М.Ходанич Корректор С.Черни
Заказ 3596/58 Тираж 347Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
2
0,1, 0,6
0,3, 0,7
1,3
0,1 0,2 0,4 0,3 1,2
аланил-0-изоглютаминш1-1-лизил LLH-RH, заключающийся в том, что гормон LH-RH в кислой форме вводят во взаимодействие с М-ацетилмурамил- 1-аланил-0-изоглютаминил-1-лизилом при массовом соотношении 1:1 в водно -формамид ной среде карбоднимидньм методом в присутствии 1-оксибензо- триазола с последующим вьщелением целевого продукта на молекулярном сите,
Изобретение касается производных пептидов, в частности сопряженного соединения гаптена и мурамил- пептида формулы: М-ацетилмурамил-и- aлaнил-D-изoглютaминил-L-лизил LH-RH (СГМ),которое обладает биологической активностью и может быть использовано в медицине. Цель - создание активных веществ указанного класса. Синтез СГМ ведут из гормона LH-RH в кислой форме и N-ацетил- мурамил-1-аланил-0-изоглютаминил-1- лизина при массовом соотношении 1:1, в водно-формамидной среде карбодиимид- ным методом в присутствии 1-оксибен- зотриазола. Выделение СГМ ведут с помощью молекулярного сита. Испытания СГМ показывают, что оно обладает высокой иммуногенной активностью на уровне соответствующего мурамшт- трипептида, но при зтом проявляет более низкую пирогенность. 2 табл. СО 00 00 4;: 00 оо
| Шредер Э.,Любке К | |||
| Пептиды, Мир, 1967, ч.I, с.II6. |
