Способ получения н-бутиловых эфиров производных N-ацетилмурамилпептидов Советский патент 1987 года по МПК C07K9/00 A61K38/14 

Изобретение относится к способу получения новых химических соединений, конкретно н-бутиловых эфиров производных N-ацетилмурамилпептидов общей формулы

СН20Я(I),

J-0

СНз-Ш НСОСНз

CO-X- NH-CH-COOC ifcHg-H

CH2CH.7CO NH2

где R - сукцинил, -аминокапроил;

X - L-Ala,

обладающих иммуностимулирующей активностью, и может найти применение в экспериментальной биологии и медицине.

Цель изобретения - разработка

способа получения производньгк N-аце тилмурамилпептидов, обладающих высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой пирогенностью.

Поставленная цель достигается тем что согласно предлагаемому способу защищенное производное N-ацетилмура- милпептида общей формулы

РЬ .ОСН2

X -о

W 1н,ОВг1 о( или р 1 НСОСНз

со-х--ын-сн-соос Нэ-н

СН2СН2СО Н2

где X - имеет указанное значение; Ph - фенил;

Bzl - бензил, обрабатывают 60%-но уксусной кислотой для удаления бен- зилиденовой защитной группы, а затем подвергают взаимодействию с янтар- ным ангидридом или п-нитрофениловым эфиром N-бензилоксикарбонил-б-амино- капроновой кислоты и от полученного соединения общей формулы j-0

и р СНз-СН 1 НСОСНз

го -X-lsIH- СН-СООС Н

CH2CH2CONH2

где R - сукцинил, N-бензилоксикар- бонил- -аминокапроил;

Bzl и X имеют указанные значения отщепляют защитные группы путем каталитического гидрогенолиза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. н-Бутиловый эфир 6-0-сукцинил-Ы-ацетилмурамил-Ь-ала- нил-О-глютамина (1а).

1.1.н-Бутиловый эфир сб-бензил-Ы- ацетилмурамил-L-аланил-В-глютамина (Па).

3,634 г (5,0 ммоль) н-бутилового эфира oi -бензил-4 , б-О-бензилиден-N- ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина суспендируют в 250 мл 60%-ной уксусной кислоты. Суспензию нагревают на

кипящей водяной бане до полного растворения. Раствор фильтруют для удаления нерастворившихся частиц, фильтрат упаривают досуха. Полученный продукт очищаютна колонке с силикагелем, используя в качестве элюента

смесь хлороформ - метанол (6:1),фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают и лиофилизуют. Получают 1,95 г (61%)

+107,9° (С I; ДМФА).

Найдено,%: С 55,3; Е1 7,0-; N 7,6;

1.2.н-Бутиловый эфир об -бензил- б-О-сукцинил-М-ацр-тилмурамил-Ь-ала- нил-В-глутамина (Ilia).

К раствору 638,7 мг (1,0 ммоль) На в 5 мл безводного пиридина добавляют 150,1 мг (1,5 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при 40°С, охлаждают до

О , добавляют безводный эфир. Выпавший осадок отделяют, растворяют в метаноле с добавкой уксусной кислоты. Раствор упаривают досуха, полученный кристаллический сироп растворяют

в смеси ДМФА - вода (1:1) и подвергают хроматографической очистке на колонке с AGI-X-2, используя в качестве элюента раствор уксусной кислоты в ДМФА- с градиентом О - 1 н. (2 х

X 250 мл). Продукт элюируют 0,5 н. раствором уксусной кислоты в ДМФА. Фракции, Содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают и дважды лиофилизуют из уксусной кислоты.

Получают 659 мг (89%) IIIa; ciTo +67,5° (С 0,5; уксусная кислота).

Найдено,%: С 33,3; Н 6,3; N 6,8.

,, 1,5 СНгСООН Рассчитано,%: С 53,6; Н 6,8; N 6,8.

1.3.н-Бутиловый эфир 6-0-сукци- нил-Ы-ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глю- тамина (1а) .

3

412 мг 11 la,растворенного в 25 мл ледяной уксусной кислоты, гидрируют в течение 40 ч в присутствии 200 мг 10%-ного палладия на угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток очищают хромато- графически на колонке с силикагелем используя в качестве элюента смесь

этилацетат - пиридин - уксусная кис- ю последовательно 5%-ным раствором лота - вода (6:2:0,6:1), Содержание NaHCO, и насьпценным раствором NaCl, целевого продукта во фракциях определяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем

сушат над и упаривают. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем 60 /Мерк/, ис- в системе хлороформ - метанол (2:1). 15 пользуя в качестве элюента смесь Фракции, содержащие целевой продукт, роформ - метанол (10:1).

объединяют, упаривают, лиофилизуют. Получают 556,2 мг (64%) III6. Получают 269,6 мг (81%) продукта,ко- 2.3. н-Бутиловый эфир 6-0- -амино- торый растворяют в воде и хроматогра- кaпpoил-N-aцeтилмypaмил-L-aлaнил-D- фируют на колонке с AG50WX2 (13 х 20 глютамина (16).

X 1,5 см). Фракции, содержащие целевой продукт, лиофилизуют.

Получают 217 мг )i +33,1° (С 1,0; уксусная кислота).

Найдено,%: С 28,8; Н 6,6; N 8,5.

,0,,N, 0,

Рассчитано,%: С 28,9; Н 6,9; N 8,5.

П р и м е р 2. н-Бутиловый эфир

6-0-6-аминокапроил-Ы-ацетилмурамил- Ь-аланил-В-глютамина (16).

2.1. п-Нитрофениловый эфир N-бен- зилоксикарбонил- -аминокапроновой кислоты (116).

556,2 мг (0,64 ммоль) III6 растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 280 мг 5%-ного палладия на угле. Через 40 ч

25 катализатор отфильтровывают, фильтрат лиофилизуют. Полученный продукт растворяют в 20 мл воды, содержащей 0,7 мл 0,1 и. соляной кислоты и вновь лиофилизуют.

30 Получают 393,6 мг (54%) I6,oi

+32,8° (С 0,5; уксусная кислота).

Найдено,%: С 47,7; Н 7,2; N 9,3;

.,-

Рассчитано,%: С 47,4; Н 7,2;

2,653 г (10 ммоль) Ы-бензилокси- -jg N 9,3. кар6онил-6-аминокапроновой кислоты Иммуностимулирующая активность

описываемых соединений была изучена в опытах in vivo в сравнении с известным структурным аналогом - Nрастворяют при О С в 25 мл ацетонитрила, содержащего 1,675 г (12 ммоль)

п-нитрофенола. К раствору добавляют

2,125 г (10,25 ммоль) дициклогексил- до ацетилмурамил-Ь-аланил-В-изоглютамикарбодиимида. Реакционную смесь пе- ном (МДП).

ремещивают ночь при температуре окру-, Токсичность

жающей среды, затем добавляют нес- Токсичность соединений 1а и 16

колько капель уксусной кислоты. Быбьша изучена на кроликах при паренобладают токсическим действием. Способность вызьшать лихорадку.

павшую в осадок дициклогексилмочеви- теральном введении. Установлено, что ну отфильтровывают, промывают ацето- , соединения в дозах до 5 мг/кг не нитрилом, фильтрат упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат - гексан.

Получают 3,831 г (99%) продукта, т.пл. 62,3 С.

Найдено,%: С 62,4; Н 6,0; N 7,5.

gQ Изучено влияние описываемых соединений на изменение температуры у кроликов в течение 3ч после иквве- - дения. Соединения 1а и 16 в дозе до 5 мг/кг не вызывали значительных изС-2оН«,Ое N

Рассчитано,%: С 62,2; Н 5,7; N 7,3.

2.2. н-Бутиловый эфир о -бензил- 6-0-Й-6ензйлоксикарбонил- -аминокап- poшl-N-aцeтил-L-aлaншI-D-глютaминa (III6).

772,8 мг (2,0 ммоль) 116 и и 638,7 мг (1,0 ммоль) На растворяют в 5 мл ДМФА в присутствии 540 мг (4,0 ммоль) N-оксибензотриазола и 0,44 мл (4,0 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь вьщерживают 24 ч и упаривают досуха. Остаток растворяют в этилацетате. Раствор промывают

556,2 мг (0,64 ммоль) III6 растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 280 мг 5%-ного палладия на угле. Через 40 ч

катализатор отфильтровывают, фильтрат лиофилизуют. Полученный продукт растворяют в 20 мл воды, содержащей 0,7 мл 0,1 и. соляной кислоты и вновь лиофилизуют.

Получают 393,6 мг (54%) I6,oi

+32,8° (С 0,5; уксусная кислота).

Найдено,%: С 47,7; Н 7,2; N 9,3;

.,-

Рассчитано,%: С 47,4; Н 7,2;

N 9,3. Иммуностимулирующая активность

бьша изучена на кроликах при паренобладают токсическим действием. Способность вызьшать лихорадку.

теральном введении. Установлено, чт , соединения в дозах до 5 мг/кг н

Изучено влияние описываемых соединений на изменение температуры у кроликов в течение 3ч после иквве- - ения. Соединения 1а и 16 в дозе до 5 мг/кг не вызывали значительных изменений температуры. Соединение 1а в дозе 10 мг/кг вызывало повышение температуры на 0,53°С, а соединение 16 в дозе 5 мг/кг - на 0,1-0,3 С. Таким образом, описываемые соединения практически не обладают пироген- ной активностью.

Иммуностимулирующая активность, В опытах на мышах бьша изучена способность соединений 1а, 16 и МДП влиять на антителообразование. В качестве антигена использовали бычий сьшороточный альбумин (БСА) в дозе 500 мкг на одно животное. Группам по 8 мьшей швейцарской породы в возрасте 2 мес вводили подкожно 500 мкг БСА с добавкой изучаемых соединений в дозе 00 мкг в изотоническом физиологическом растворе. Контрольной группе вводили толь1 о БСА, Через 21 день определяли содержание антител методом пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов баранов у обработанных формалином (первичный отзыв), Затем животным повторно вводили 500 мкг БСА и через 6 дней определяли содержание антител (вторичный отзыв),

Полученные результаты представлены в таблице,

Содержание антител указано в логарифмических величинах по- основанию 2.

Таким образом, соединения, получаемые согласно предлагаемому способу, обладают высокой иммуностимули- рукщей активностью в сочетании с низкой пирогенностью.

ЗА6046

Формула

6

изобретения

5

Способ получения н-бутиловых эфи- ров производных N-aufeтилмypaмилпeп- тидов общей формулы

1-0 нпФ )|Н.ОН d, или р

yff

Ъ НСОСН

CO-X-NH-СН-СООС/tHg-H

где R - сукцинил, 6-аминокапроил;

X L-Ala,

отличающийся тем, что из н-бутилового эфира защищенного производного N-ацетилмурамилпептида общей 0 формулы

РЬ ОСШ

о

О NH,OBzl л или А

CHj-CH знcocн5

CO-X-NH-CH-COOCiiHg-H

где X имеет указанное значение; Ph - фенил; Bzl - бензилJ

путем обработки 60%-ной уксусной кислотой удаляют защитную бен- эилиденовую группу с последующей обработкой полученного соединения янтарньм ангидридом или п--нитрофениловым эфиром N-бензйлокси- карбонил-6-аминокапроновой кислоты и от полученного соединения общей формулы

сщок,

J-0 «пШ NH OBzl а или Э

HUiyJ ./

0

5

CHj-CH -NHCOCH

СО -Х--ЫН- СН- СООС

CM,2CH7.CONH2

де R, - сукцинил, N-бензилоксикар- бонил- -аминокапроил;

X и Bzl Имеют указанные значения, отп1;епляют защитные группы путем каталитического гидрогенолиза.

Изобретение касается пептидов, в частности получения N-ацетилмура- милпептидов (АП) общей формулы I сн,т АО HflV Н,ОН iUM,J) НиЛ| у НзС-СН-ОДХА/НСН СН CHj C(OJffH -C(0)ORi где X - L-аланил; L - серил; L - .валил; R - ,д-алкил нормально го или изостроения, которые могут .быть использованы в медицине для лечения инфекционных заболеваний.Цель создание новых активных пептидов, обладающих иммунорегулирующими| свойствами при низкой пирОгенности,Получение АП ведут конденсацией производного мурамиловой кислоты формулы 11 и пептида формулы I11 И ш,01(аили ру НзС-СН-С(0)ОУ CH 2CH2C(0)NH2 HX-T H-CH-aOQ-Ri где RI бензил; Y - И или - ifl-C(O) (С}{)С(0); X и R, указаны вьше, с последующим отщеплением защитных групп с помощью каталитического гидрирования в присутствии , Испытания АП Локазывают, что они проявляют кммунорегулирую- щее действие и противоинфекционную активность при низкой пирогенности и токсичности. I табл. СУ) со 4 Oi О О5 CrJ

ВНИИПИ Заказ 4935/57 Тираж 347 .Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4