Способ получения N-ацетилмурамилпептидов Советский патент 1987 года по МПК C07K9/00 A61K38/14 

Изобретение относится к способу получения новых биологически активных Н-ацетилмурамилпептидов общей формулы

H,OH(ciu.nu р)

КНСОСНз

CO-X-l: H-CH-COQRi

Ш2СН2С01 Нг

где X - L-аланил, L-серил, L-валил; R - линейный или разветвленный

,-алкил,

которые могут найти применение в медицине .

Цель изобретения - получение новых биологически активных N-ацетилмура- милпептидов, обладающих иммунорегу- лирующими свойствами в сочетании с низкой пирогенностыо.

Пример 1, Метиловый эфир N- ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина f I

а) Метиловый эфир N-трет-бутилок- сикарбонил-В-глютамина (II).

К раствору 1,5 г (6,2 ммоль) N- трет-бутилоксикарбонил-В-глютамина в 60 мл абсолютного метанола при О С прибавляют по каплям раствор диазо- метана в эфире до появления желтой окраски у реакционного раствора, перемешивают реакционную смесь 10 мин при и 10 мин при комнатной температуре. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии (тех) на пластинках с силикагелем с использованием систем растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), н-бутанол - пиридин - уксусная кислота - вода (30:20:6:24) и хлороформ - метанол (5:1). После окончания реакции избыток диазометана разлагают добавлением уксусной кислоты. Затем реакционную смесь упаривают досуха, остаток растворяют в минимальном количестве этилацетата и продукт осаждают из раствора дрбав лением петролейного эфира.

В итоге получают 1,42 г (89,7% | соединения (II) с .т.пл. 86-90°С; е +24,7° (С 1; метанол).

Найдено, %: С 50,62; Н 7,75; N 10,82.

Рассчитано, %: С 50,76; Н 7,75; N 10,76.

0

15

20

25

30 25 40 45gg

5

б)Метиловый эфир N-трет-бутилок-в сикарбонил-Ь-аланил-В-глютамина (III).

1,4 г (5,4 ммоль)соединения (II) обрабатывают 1 н.раствором соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Реакционную смесь выдерживают30 мин, упаривают досуха, остаток сушат в вакууме над КОН и растворяют в 25 мл ДМФА. К полученному раствору прибавляют 0,6 мл (5,4 ммоль) N-метилмор- фолина и 1,86 г (6,5 ммоль) N-окси- сукцинимидного эфира N-трет-бутилок- сикарбонил-Ь-аланина. Реакционную смесь оставляют на ночь и затем упаривают досуха. Остаток растворяют в смеси хлороформ - изопр опанол - уксусная кислота (100:0,5:0,62) и хрома- тографируют на колонке (27x3 см), заполненной двуокисью кремния, с ис-. пользованием в качестве элюента системы хлороформ - изопропанол - уксусная кислота (100:5:2). Фракции, содержащие продукт, обьединяют и упаривают досуха. Остаток кристаллизуют из смеси изопропанол - изопропиловый эфир.

Б итоге получают 1,035 г соединения (III) с т.пл. 115-116°С;Гс/ д -9°( метанол).

Найдено, %: С 50,79; Н 7,40; N 12,42.

C.

Расчитано, %: С 50,74; Н 7,60; N 12,68.

в)Хлоргидрат метилового эфира L- аланил-В-глутамина (IV).

332 мг (1 ммоль) соединения (III) обрабатывают 3 мл 1 н, соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Реакционную смесь выдерживают 30 мин и упаривают досуха. Полученное в остатке масло сушат в вакууме над КОН,

г)Метиловый эфир l-cf-0-бензил- 4,6 j О-бензилиден-Н-адетилмурамил-Ъ- аланил-В-глютамина (V).

471,5 г (1 ммоль) 1 о -0-бензил- 4,6 О-бензилиден-М-ацетилмур амиловой кислоты растворяют в 5 мл ДМФА, содержащего 0,11 мл (1 ммоль) N-метилмор- фолина. К полученному раствору прибавляют при Oj13 мл (1 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь вьщерживают 3-5 мин, прибавляют к ней охлажденный до -15°С раствор 268 мг (1 ммоль) соединения (VI) и 0,11 мл (1 ммоль) N-метилморфолина в 5 мл ДМФА. Реакционную смесь вьщерживают в течение ночи при -15 С, при31

бавляют 1 мл 2,5 М раствора бикарбоната калия, выдерживают 30 мин при О С и прибавляют воду, Выпавпгий осадок отфильтровывают, npof-ibiBaroT 1 М раствором бикарбоната калия и сушат в вакууме над Р,

В итоге получают 620 мг (90,5%) соединения (V) с т.пл. 215-220 С; tci +92, ( ДМФА).

д) Метиловый эфир N-ацетилмурамил Ь-аланил-В-глютамина (I).

587,6 мг (0,86 ммоль) соединения (V), растворенного в 35 мл ледяной уксусной кислоты, подвергают гидрированию в течение 60 ч в присутствии в качестве катализатора 450 мг 5%-но го палладия на активированном угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 0,1 М растворе ук- сусной кислоты и хроматографируют на колонке (10x1 см), заполненной ионообменной смолой Амберлит АГ 50W-X2, с использованием в качестве элюента 0,1 М раствора уксусной кис- лоты. Фракции, содержащие продукт, лиофилизуют и полученный продукт вновь хроматографируют на колонке, заполненной ионообменной смолой Амберлит АГ1 Х-2. Фракции, содер- жащие продукт, лиофилизуют. В итоге получают 290 мг продукта, который растворяют в смеси н-бутанол - уксусная кислота - вода (65:10:25) и хроматографируют на колонке, заполнен- ной силикагелем, с использованием в качестве элюента системы н-бутанол- уксусная кислота - вода (65:10:25), Фракции, содержащие продукт, объединяют и экстрагируют водой. Водную фазу отделяют и лиофилизуют.

В итоге получают 234,4 мг соединения (I) с т.пл. 108-112°C;foi j +34,3 ( ледяная уксусная кислота) .

Найдено, %: С 45,46; Н 6,76; N 10,56.

С2оНз4 N401,-1,25 HiO

Рассчитано, %: С 45,50; Н 6,95;

N 10,59.

Пример 2. н-Бутиловый эфир К-ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина (VI)

а) Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аланилD-глютамина (VII)

2,4 г (16,4 ммоль). D-глютамина растворяют при нагревании в 35 мл воды К раствору прибавляют 2,3 мл (16,4 ммоль) триэтиламина и 4,62 г

974

(14,4 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аланина в 70 мл безводного тетрагидрофурана. Реакционную смесь .выдерживают 48 ч при 4 С,прибавляют 0,5 мл (3,85 ммоль) диметиламинопропиламина, выдерживают реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре, разбавляют 65,мл воды к подкисляют 4 н.НС1-при 0°С до рН 2,2-3,0. Затем тетрагидрофуран отго- |Няют в вакууме, а остаток выдерживают ночь при . Выпавший осадок отфильтровывают, промывают минимальным количеством охлажденной воды и кристаллизуют из этанола.

В итоге получают 2,87 г (62%) соединения (VII) с т.пл. 179-182 С; -13,3 ( метанол).

Найдено, %: С 54,18; Н 5,80; N 11,77,

Cfb itNiO.

Рассчитано, %: С 54,69; Н 6,02; N 11 ,96,

б) н-Бутиловый эфир N-бензилокси- карбонил-Ь-аланил-П-глютамина (VIII).

350 мг (1 ммоль) соединения (VII) растворают в смеси 15 мл тетрагидрофурана и 5 мл воды. К раствору прибавляют водный 20%-ный раствор CSjCO (1 ммоль). Раствор упаривают досуха, остаток растворяют в ДМФА и вновь упаривают, остаток сушат над Р205. Эту процедуру повторяют несколько раз. Полученный в итоге сухой остаток растворяют в 30 мл ДМФА. К полученному раствору прибавляют 0,12 мл (1,1 ммсль) 1-бром-н-бутана, вьщержи- вают 20 ч, контролируя окончание реакции с помощью ТСХ на силикагеле в системе этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода (6:2:0,6:1), добавляют 0,06 мл (0,55 ммоль) 1- бром-н-бутана, вьщерживают 20 ч,упаривают до минимального объема и про- гдукт осаждают водой.

В итоге получают 332 мг (81,5%) соединения (V11I) с т.пл, 148-150 С,

Найдено, %: С 58,91; Н 7,12; N 10,26.

CeoHjjNjO

Рассчитано, %: С 58,95; Н 7,17; N 10,31.

в) н-Бутиловый эфир Ь-аланил-В- глютамина (IX),

330 мг (0,8 ммоль) соединения (VIII), растворенного в 30 мл ладя- . ной уксусной кислоты, подвергают гидрированию в течениеь 4 ч в присутствии в качестве катализатора 330 мг

513

5%-ного палладия на активированном угле и 1 мл 1 н. НС1. Окончание реакции контролируют с помощью тех на силикагеле в системе этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода (6:2:0,6:1). После окончания реакции катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток сушат в вакууме над PJ О, . В итоге получают 254 мг (100%) соединения (IX) в виде масла.

г) н-Бутиловый эфир 1 о/-0-бензил- 4,6-0-бенэилиден-Ы-ацетилмурамил-Ь- аланил-В-глютамина (X),

Получают аналогично примеру 1 (стадия г), исходя из 0,9 ммоль 1-о/- О-бензил-4,6-0-бензилиден-К-ацетилму рамиловой кислоты и 0,8 ммоль соединения (IX). В итоге получают соединение (X) с выходом 81,2%,, т.пл. 220- 235 с;Гй д +82,6° ( ДМФА).

Найдено, %: С 61,77; Н 7,03;

N 7,03.

N

,, Рассчитано, %: 7,71.

С 61,14; Н 6,93;

д) н-Бутиловый эфир N-ацетилмура- мил-Ь-аланил-В-глютамина (VI).

472 мг (0,6 ммоль) соединения (X) растворенного в 30 мл ледяной уксусной кислоты, подвергают гидрированию в течение 40 ч в присутствии в качестве катализатора 470 мг 5%-ного палладия на активированном угле. После окончания реакции, которая контролируется с помощью тех на силикагеле в системе хлороформ - метанол (50:15 катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в смеси хлороформ - метанол (50:15) и хроматографируют на колонке, заполненной силикагелем-60 (33 г), с использованием в качестве элюента системы хлороформ - метанол (50:15). Фракции, содержащие продукт, объединяют, и упаривают досуха. Остаток растворяют в воде, раствор подвергают ультрофилътрации и затем лио- филизуют.

В итоге получают 157 мг ( 48%) соединения (VI) +34,8° (, уксусная кислота).

Найдено, %: С 48,26; Н 7,08; N 9,74.

C2 H4oN40;,-1/3

Рассчитано,%: С 48,24; Н 7,50; N 9,78.

П р и м е р 3. н-Дециловый эфир К-ацет тмурамил-Ь-аланил-В-глютамина (XI).

Проводят аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XI) с +30°С ледяная уксусная кислота), т.пл. .

Найдено, %.: С 53,97; Н 8,06;. N 8,47.

29 И52N4071 0.15 СНС1з .

Рассчитано, %: С 53,97; Н 8,08; N 8,61.

I Пример 4. н-Пропиловый эфир К-ацетилмурамил-Ъ-аланил-В-глютамина (XII).

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XII) с 0 +32,3 ( ледяная уксусная кислота).,

Найдено, %, С 44,5; Н 6,30; N 8,40.

CjiHjgN o., 0,6 cHcij- ацсоон

Рассчитано, %: С 44,4; Н 6,40; N 8,40.

Пример 5. н-Гексиловый эфир Н-ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина (XIII).

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XIII) +29,5° ( ледяная уксусная кислота).

Найдено, %: С 49,4; -Н 7,40; К9,10.

С25Н44М40«-0,ЗСНС1з

Рассчитано, %: С 49,6; Н.7,30; . N 9,10..

Пример 6. Этиловый эфир N- ацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина (XIV).

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XIV) с Г( +34 ( ледяная уксусная кислота).

Найдено, %: С 46,4; Н 7,1; N 10,3.

Cj, Hj,N,0,,

Рассчитано, %: С 46,4; Н 7,3; N 10,2.

Пример 7. н-Пентиловый эфир М-тацетилмурамил-Ь-аланил-В-глютамина (XV).

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XV) с ( +36,5° ( ледяная уксусная кислота).

Найдено, %: С 49,3; Н 7,7;N 9,6.

C2 H 2N40ii 1,

Рассчитано, %: С 49,4; Н 7,6; N 9,3.

Пример 8. н-Бутиловый эфир N-aцeтилмypaмил-L-вaлил-B-глютaминa (XVI).

713

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XVI) с , ( ледяная уксусная кислота),

Найдено, %: С 50,5; Н 7,5; N 8,6.

Cj N4 0,25CHj СООН. Н. О

Рассчитано, %: С 50,52; Н 7,86; N 8,57.

Пример 9. н Бутиловый эфир М-ацетилмурамил-Ь-серил-Б-глютамина (XVII).

Синтезируют аналогично примеру 2. В итоге получают соединение (XVII) с +39,4 (С-1; ледяная уксусная кислота).

Найдено, %: С 48,8; Н 7,0; N 9,8.

С,,Н,, N,0,2

Рассчитано, %: С 48,9; Н 7,14; N 9,9.

Полученные N-ацетилмурамилпептиды изучены в качестве иммунологических добавок.

Токсичность N-ацетилмурамилпепти- дов, полученных согласно .предлагаемому способу, изучена на кроликах при парентеральном введении. При этом установлено,что токсические дозы изученных соединений значительно выше доз, при которых обнаруживается их активность. Токсические эффекты наб- людаются при дозах,равных или превышающих 5 мг/кг.

При определении пирогенной активности изучалось изменение температуры тела у кроликов в течение 3 ч после введения N-ацетилмурамилпептидов, Полученные результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

5

С

5

0

30

°

5

5

978

Из приведенных в табл. 1 данных можно сделать, вывод о том, что в дозах -, при которых проявляется активность предлагаемых соединений, они не обладают способностью вызывать лихорадочные явления.

При определении активности в качестве иммунологических добавок в водной фазе изучено влияние ,N-ацетилмурамилпептидов, получаемых согласно предла-, гаемому способу, на количество анти-. альбуминовых антител. Группам по 8 мышей швейдарской породы возрастом 2 мес вводят подкожно 0,5 мг антигена,, состоящего из бычьего сывороточного альбумина без или с добавкой изучаемых соединений в изотоническом солевом растворе в количестве 0,1 мг. Антиген без добавки изучаемых соединений служит контролем. Спустя 30 дн мышам вводят подкожно тот же антиген в дозе 0,1 мг. Одновременно для сравнения исследуют воздействие в качестве иммунологической добавки известного иммуностимулятора - 2-(2-ацетамидо-2-дез- окси-3-0-В-глюкопиразонил)-В-пропио- нил-Ь-аланил-В-изоглютамина (МДП)«

Количество антител определяют пассивной гемагглютинацией с использованием эритроцитов баранов, обработанных формалином и покрываемых изучаемыми антигенами. Исследования проводят после первой инъекции антигена и после повторной инъекции для определения первичного и вторичного иммунного отзыва.

Показатели количества антител выражают через логарифм с основанием 2 максимального разбавления сыворотки, агглютинирующей определенное количество красных кровяных телец крови баранов.

Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

3,57+1,78 8,ЗА±1,34 8,43+1,52 8,72+1,23

Полученные результаты показывают, что предлаг аемые соединения, вводимые в солевом изотоническом растворе, вызывают заметное увеличение количества образуищихся антител.

При определении активности в каче- стве иммунологических добавок в масляной фазе. Изучалось увеличение коли- -чества специфических антител, вырабатываемых антигеном, после его введения в присутствии добавок исследуе- мых соединений, вводимых в виде эмульсии вода в масле. Опыты проводят на морских свинках-самках весом 350 г (группы по 6 особей). Препараты вводят подкожно в подушечки обеих задних лапок, Овальбумин из расчета 1 мг в ёиде эмульсии 0,1 мл изотонического солевого раствора в масляной форме, , состоящей из неполного адьюва нта Фрей да (НАФ), Исследуемые соединения вво- дят в количестве 0,1 мг в виде добавки к эмульсии, Содержащей НАФ. Для .- сравнения проводят опыты с использованием в качестве добавки МДП. Через 18 дн после иммунизации исследуют возможные проявления заторможенной сверхчувствительности по отношению к антигену, для чего вводят подкожно в бок животного 0,01 мг овальб мина, и через 48 ч наблюдается реакция в месте введения овальбумина, размер выз- ваннопэ .раздражения измеряют в -.5Илли- метрах. Через 21 день после инъекции животным пускают кровь и измеряют в полученной сыворотке содержание анти- тел, специфических по отношению к овальбумину , в результате осаждения ,комплекса антитело - антиген в зоне равновесия. Количество белкового азо

та, содержащегося в осадке, определяют по методу Фолина.

Средние значения содержания антител приведены в табл. 3, Эти величины обозначают количество азота в белке, осаждаемом антигеном, в микрограммах в 1 мл сыворотки.

Таблица 3

5

п

5 QL Q г

5

0

Из полученных результатов следует, что изученные соединения, вводимые в виде маслообразной эмульсии, позволяют значительно, увеличить количество антител, образующихся в ответ на введение антигена, а также вызывают появление заторможенной сверхчувствительности по отношению к тому же антигену, причем оба указанных воздействия по к райней мере равны, в отличие от эффектов, наблюдаемых при использовании в качестве добавки МДП.

Исследование противоинфекционной активности по отношению к Klebsiella проводят по известной методике. Klebsiella pneumouiae, вводимая в дозе 1-2 .10 внутримьшаечно мышам, вызывает смерть большей части,если не всех животньгх, в течение недели после введения. Спустя 8 дн выживаемость животных значительно увеличивается. Проводят наблюдение за степенью выживаемости у групп мышей, зараженных в приведенных условиях и обработанных описываемыми N-ацетилмурамилпептидами. Для проведения опытов используются мьшш гибридной породы (C57B1)6xAKR/F1. поставляемые институтом Пастера, где они получены от пotloды, поставляемой C.N.R.S. в Орлеане. Инфекционную культуру Klebsiella pneumoniae штамм кап- суларного типа 2, биотипа d, получают из 16-часовой культуры в среде для получения пневмококков (№ 53515, институт Пастера), Доза заражения 2 10 Klebsiella, которая вводится внутримьш ечно. Исследуемые соединения

II13

вводятся внутривенно в 0,2 мл зпиро- генного физиологического раствора. Контрольным животным вводится только физиологический раствор. Исследуемые соединения вводят животным через 24 -ч после заражения. В результате проведенных исследований установлено, что соединения VI и XI проявляют противо инфекционную активность, что следует из более высокого процента выживших животных по сравнению с контрольной группой.

Данные по противоинфекционной активности соединения VI представлены в табл. 4.

Таблица

12

Исследование влияния на коагуляци

крови проводят по известной методике

Все количество крови, взятой для опыта, делится на две части, одна из которых центрифугируется для получения плазмы без тромбоцитов (ПБТ). 1 мл крови инкубируется в пластмассовой капсуле в присутствии 100 мкг исследуемого соединения. Кроме того, приготавливают капсулы, содержащие 0,1 мл ПБТ, к которым добавляют чере каждый час в течение 5 ч по 0,1 мл инкубационной смеси, после чего по 0,1 мл 0,025 М раствора хлористого кальция. Измеряют время коагуляции и определяют активность изученных соединений по отношению к коагуляции в виде зависимости сокращения времени коагуляции по отношению к контрольному образцу, в котором используется физиологический раствор. Полученные результаты сравниваются с результатами, полученными с липополи- сахаридом (ЛПС) - веществом, значительно способствующим коагуляции, взятым в качестве эталона.

Полученные результаты представлены в табл. 5.

В результате проведенных исследований установлено, что предлагаемые соединения в отличие от ЛПС не ускоряют коагуляцию крови.

Формула изобретения

Способ получения N-ацетилмурамил- пептидов общей формулы

СН20Н

-о

(10 H,OH(oL или |5)

0

0

5

-NRCOCHj

TDX- NH-GH-COORi

CH CH CONHi ,

f

где X - L-аланил, L-серил, L-валил; R - линейный или разветвленный

С -С -алкил,

отличающийся тем, что, защищенно.е производное мурамиловой кислоты общей формулы

/ОСН2 Ph-CH -0 Q UAup)

0/J-/ СНзСН Т НСОСНз

COOY

где Ph - фенил; R2 - бензил;

Y - водород.

°V

Ч

0з40

55

конденсируют с дипептидом общей мулы

H-X- NH-CH-COORi

СН2,СН2СОТ Н2.

13132619714

где X и R имеют указанные значения, групп путем каталитического гидриро- с последующим отщеплением защитных вания в присутствии уксусной кислоты.

Изобретение касается замещенных пептидов, в частности получения производных N-ацетилмурамилпептидов (МП) общей формулы СН20Н /-Я.Н,ОН(с1 uftu р Ho)SY HjC-CHK , iSt