Способ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот в биологическом материале Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

13322272

Изобретение относится к биологии метр KEVEX-51ОО, установленный на и медицине, преимушественно к липидо- логии, и может быть использовано для определения фосфолипидов и свободных (СЖК) в биологическом

ткирных кислот материале.

Цель изобретения - ускорение способа за счет одновременной экстракции

базе сканирующего электронного микр скопа Hitachi S-500. Угольные подложки диаметром 6,5 мм и высотой 2- 3 мм изготавливаются из углеродных стержней, применяемых в электронной микроскопии для напыления, и не имею собственных пиков характеристическо

определяемых веществ и определения излучения в рабочем диапазоне энерсодержания в одном образце о

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракцию липидов из биологического материала проводят смесью эта- нол-диэтиловый эфир в соотношении спирт:диэтиловый эфир 1,0:1,0 (по

объему), взятой в количестве 2,5 объема по отнощению к пробе, при добавлении к образцу азотнокислого или сернокислого кадмия в конечной концентрации 10 мМ при рН 8,0. Разделение фаз проводят путем добавления воды и диэтилового эфира в количестве 1,2 и 1,0 объемов соответственно; 25 следуют смеси стеариновой кислоты с

таким образом, конечное соотношение вода:спирт:эфир равняется 2:1:2. Затем верхняя фаза отбирается.

Вторым этапом является дополнительная экстракция водно-спиртовой фазы пентаном, взятым s соотношении 2:1:2. Приливают пентан, интенсивно встряхивают смесь в течение 3 мин, дожидаются расслоения, верхнюю фазу

лецитином или кефалином в соотношении СЖК/ФЛ - 10, 20, АО и 100 мол.% с экстракцией и последующими манипуляциями описанным способом. Порог 30 количественного определения равняется 5 нмоль, а оптимальный диапазон определения 25-200 нмоль„

Способ может быть употреблен для оценки степени гидролиза фосфолнпи-

отбирают и приливают к первому экст- 5 фосфолипазами. Степень гидролиза

ракту. Объединенные экстракты центрифугируют при 3000-5000 g 20 мин при этом происходит удаление воды из экстракта обычно в количестве

40

(мол.%) легко оценивать по соотношению импульсов характеристического излучения кадмия по отношению к фосфору.

Пример. Предлагаемый способ применяют для определения содержания фосфолипидов и СЖК в митохондриях печени белых крыс при активации собственной фосфолипазы. Для этого ин0,1-0,2 объема. Затем верхнюю фазу отбирают, приливают к ней по 0,1 объемной части спирта и толуола и упаривают, под вакуумом досуха.

Третьим этапом является формирование тонкой пленки липидов на угольной 45 кубируют изолированные митохондрии

подложке. Для этого проводят раство-(8,75 мг белка) в изотоническом растрение экстракта в небольшом количест-воре КСР при рН 8,0 в присутствии

ве диэтилового эфира и наносят его1 мМ CaCEj общим объемом 2,5 мл в

.каплями на отполированную угольнуютечение 60 мин„ Через каждые 10 мин подложку. 50 производит отбор в количестве 0,2 мл

Последний этап включает в себяпо 3 пробы на определяемую точку,

регистрацию рентгеновской флуоресцен-Далее проводят операции по определеции и расчет содержания фосфолипидовнию фосфолипидов и СЖК. С.этой целью

и СЖК по интенсивности рентгеновскогокаждую пробу, содержащую 0,7 мг бел- излучения фосфора и кадмия соответст- gg ка митохондрий вводят в стеклянную

венно с использованием предваритель-пробирку объемом 5 мп с пластмассоно построенной калибровочной кривой вой пробкой, где находятся 0,6 мл

Для отработки метода используютазотнокислого кадмия в концентрации

рентгеновский энергетический спектро-13,3 мМ. Затем добавляют .1 нл этнло-..

метр KEVEX-51ОО, установленный на

базе сканирующего электронного микроскопа Hitachi S-500. Угольные подложки диаметром 6,5 мм и высотой 2- 3 мм изготавливаются из углеродных стержней, применяемых в электронной микроскопии для напыления, и не имеют собственных пиков характеристического

гий. Рентгеновскую флуоресценцию регистрируют при условиях: ускоряющее напряжение 20 кВ, расстояние между образцом и детектором - 10 мм, угол наклона образца - 30°, площадь регистрации 0,5 X 0,5 мм, щирина кангша амплитудного анализатора 10 эВ на. канал, эффективное время регистрации 100 с. Единицей измерения служит величина IOTH отношение числа импульсов характеристического излучения к фоновому в диапазонах 1,91-2,11 для фосфора и 3,03-3,23 для кадмия. Для построения калибровочной кривой ислецитином или кефалином в соотношении СЖК/ФЛ - 10, 20, АО и 100 мол.% с экстракцией и последующими манипуляциями описанным способом. Порог количественного определения равняется 5 нмоль, а оптимальный диапазон определения 25-200 нмоль„

Способ может быть употреблен для оценки степени гидролиза фосфолнпи-

фосфолипазами. Степень гидролиза

(мол.%) легко оценивать по соотношению импульсов характеристического излучения кадмия по отношению к фосфору.

Пример. Предлагаемый способ применяют для определения содержания фосфолипидов и СЖК в митохондриях печени белых крыс при активации собственной фосфолипазы. Для этого инкубируют изолированные митохондрии

31332227

вого спирта и 1 мл диэтилового эфира, закрывают пробкой и встряхивают в течение 5-10 мин Далее добавляют 1,2 мл воды и 1 мл эфира и дожидаются полного расслоения (1-3 мин), после чего отбирают верхнюю фазу в такую же пробирку.

К оставшейся фазе приливают 2 мл пентана, закрывают пробкой и интенсивно встряхивают в течение 3-5 мин, дожидаются расслоения в течение 1 - 3 мин, затем отбирают верхнюю фазу и

приливают к первому экстракту Центри-|ц с целью ускорения способа, в качест- фугируют объединенный экстракт при 3000 g 20 мино При этом образуется нижняя фаза (водно-спиртовая) в количестве 0,1-0,3 мл о Верхнюю фазу о.тби- рают1. и переносят в другую пробирку„

20

ве солей двухвалентных металлов используют азотнокислый или сернокислый кадмий в конечной концентрации 10 мМ при рН 8,0, экстракцию проводят смесью диэтиловый эфир: этиловый, спирт в объемном соотношении 1:1, взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют диэтиловый эфир и воду до достижения соот- 25 ношения объемов диэтиловый эфир:этиловый спирт : вода 2:l:2j эфирную фазу удаляют, а к водно-спиртовой фазе дополнительно добавляют пентан в объемном соотношении 2:1:2, отбирают верхнюю фазу, а фосфолипиды и свободные жирные кислоты определяют по интенсивности характеристического рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответственно.

Добавляют по 0,3 мл спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха (20-40 мин), затем к получившемуся экстракту добавляют 0,3 мл эфира для растворения и с помощью микрошприца наносят экстракт на угольные подложки диаметром 6,5 мм, высушивая на вЬздухе, и регистрируют рентгеновское излучение с помощью микроанализатора KEVEX-5200. Рассчитывают по калибровочной кривой содержание фосфолипидов и СЖК в пробах. Полученные резуль таты представлены в табл. 1 о

230 240 235

10

220 230 240

20

215 245

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов приведена в табЛо 2,,- Формула изобретения

Способ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот и биологическом материале путем экстрагирования проб; органическими растворителями в присутствии солей двухвалентных металлов, высушивания экстракций для получения тонких пленок с последующим рентгеноспектралъным анализ ом, отличающийся .тем, что,

с целью ускорения способа, в качест-

ве солей двухвалентных металлов используют азотнокислый или сернокислый кадмий в конечной концентрации 10 мМ при рН 8,0, экстракцию проводят смесью диэтиловый эфир: этиловый, спирт в объемном соотношении 1:1, взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют диэтиловый эфир и воду до достижения соот- ношения объемов диэтиловый эфир:этиловый спирт : вода 2:l:2j эфирную фазу удаляют, а к водно-спиртовой фазе дополнительно добавляют пентан в объемном соотношении 2:1:2, отбирают верхнюю фазу, а фосфолипиды и свободные жирные кислоты определяют по интенсивности характеристического рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответственно.

Таблица 1

11,5

12

12

5 5 5,1

8,2 8,1 8,3

8,2

12,1 11,2

12,2

1332227

Продолжение табл.

Время инкубации, - мин

220

260 240 210

220 225 245

29

31

34 33

38 40 40

Экстракция липидов

смесь спирт - эфир

реэкстракция пентаном

удаление водно-спиртовой

фазы

упаривание

Приготовление проб

Регистрация характеристического излучения

14,3

17,1

Таблица

Экстракция липидов метанол-хлороформ

центрифугирование

реэкстракция метанол- хлороформом

расслоение

Определение количества ф фолипидов,

упаривание экстракта

обработка хлорной кислотой

инкубация с амидолом и молибдатом аммония

колориметрирование

Определение свободных жиных кислот

Итого

Составитель Н. Гуляева Редактор А, Ворович Техред А.Кравчук Корректор А.Обручар

Заказ 3826/40

Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

ПО.делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, А

экстракция смесью хлороформ-гептан с Ni 10

удаление фосфолипидов силикагелем10

измерение радиоактивности М на сцинтил- ляционном счетчике

85

10 260-380

Изобретение относится к биологии и медицине, и предназначено для определения фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК). Цель изобретения - ускорение способа за счет одновременной экстракции определяемых веществ и определения ИХ содержания в одном образце. Для этого проводят экстракцию липидов смесью этанол-ди- этиловьй эфир (1:1) в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют к образцу азотнокислый или сернокислый кадмий в концентрации 10 мМ при рН 8,0. Разделение фаз проводят, добавляя воду и диэтиловый эфир так, чтобы конечное соотношение было вода:спирт:эфир - 2:1:2. Верхнюю фазу отбирают, дополнительно экстрагируют водно-спиртовую фазу пентаном в соотношении 2:1:2, верхнюю фазу отбирают и приливают к первому экстракту и смесь экстрактов центрифугируют при 3000-5000 g 20 мин. Затем верхнюю фазу отбирают, приливают к ней по 0,1 об.ч. спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха. Затем формируют тонкую пленку липидов на угольной подложке, регистрируют рентгеновскую флуоресценцию и рассчитывают содержание фосфолипидов и СЖК по интенсивности рентгеновского излучения фосфора и кадмия, используя предварительно построенную теоретическую кривую. 2 табл. (Л С