Способ определения оксидазной активности церулоплазмина Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 C12Q1/26 

11334089

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии для контроля производственных процессов и в медицине для диагностических целей.

Цель изобретения - повьшение точности и чувствительности способа за счет, использования в качестве субстрата о-фенилендиамина, а в качестве

рацию ЦП в пробе.. Для рассчитанной активности она равна 0,365 ± +0,018 мг/мл.,

П р и м е р 2. Определение активности ЦП в сыворотке крови с пониженным его содержанием (при 60- С) .

В 5 пробирок вносят по 3 мл 2-10 М (210 мг/10б мл буфера) раст15

Q вора о-фенилендиамина в 0,1 М буфер- серной кисло-. ном растйоре ацетата натрия (рН 5,5), Растворы прогревают в течение 10 мин на водяной бане при 60 С, затем вносят по 0,05 мл исследуемого образца и проводят реакцию в течение 10 мин при 60°Cs Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 96%-ной серной кислоты (конечная концентрация 0,6 М) и через 10 мин измеряют оптическую плотность смеси на длине волны 492нм, В контрольную пробирку вместо раствора, содержащего фермент , добавляют О,1 мл буферного раствора. Активность ЦП определяют согласно формуле (1):

ингибирующего агента ты, .

Способ осуществляют следующим образом.

К пробе, содержащей цер; лоплазмин (ЦП), добавляют раствор о-фенилендиамина, предварительно прогретый до нужной температуры, инкубируют и останавливают реакцию добавлением 96%- ной- серной кислоты до конечной концентрации 0,3-0,6 М. Через 5 мин., измеряют оптическую плотность при 492 нм и рассчитывают активность ЦП.

Пример 1 . Определение, активности ЦП в растворе при контроле тех- 25 нологического процесса его очистки (при 37°С).

В 5 пробирок вносят по 3 мл (210 мг/100 мл; буфера) раствора о-фенилендиамина в О,1 М буфер- ЗО мерений), ,64+0,13 опт,ед,/ч.

20

А

.2

10

0492 о,27iO,02 (среднее из 5 изном растворе ацетата натрия (рН 5,5). Растворы прогрев аю-т в течение 10 мин на водяной бане при 37 С, затем в каждую из пробирок вносят по 0,05 мл

исследуемого образца и проводят реак- ор- фиков используются растворы ЦП с из.. концентрацией, которую определяют, измеряя Dg и принимая коэфцию в течение 15 мин при , Реак цию останавливают добавлением 0,0.5 мл 96%-ной серной кислоты (конечная концентрация 0,3 М) и через 5 мин Измеряют оптическую плотность смеси на длине волны 492 нм ( - контрольную пробирку вместо раствора, содержащего фермент, добавляют 0,05 МЛ буферного раствора.

Так как активность (А) ЦП принято выражать в единицах изменения оптической плотности за 1 ч, то зная Ц.((,, и время проведения определения (в данном случае 15 мин), ее рассчитывают по формуле

40

45

50

фициент зкстинкции равным 1, хЮ .М см 1

П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, однако реакцию |эстанавливают 83 мкл серной кислоты, конечная концентрация 0,5 М. . .0,480+0,071, оксидазная активность соответственно равна 1,92 ± +0,28 отн.ед/ч. При использовании калибровочного графика, при построе-- НИИ которого реакцию также останавливали добавлением 83 мкл 96%-ной к реакционной смеси, можно определить концентрацию ЦП в пробе.

D

dl2j 15 (мин)

(1)

492 у i 04 (среднее из 5 измерений),,94 + 0,15 опт,ед,/ч.

При использовании калибровочных графиков можно определить концентрацию ЦП в пробе.. Для рассчитанной активности она равна 0,365 ± +0,018 мг/мл.,

П р и м е р 2. Определение активности ЦП в сыворотке крови с пониженным его содержанием (при 60- С) .

В 5 пробирок вносят по 3 мл 2-10 М (210 мг/10б мл буфера) растений), ,6

А

.2

10

ений), ,64+0,13 опт,ед,/ч.

0492 о,27iO,02 (среднее из 5 изАналогично примеру 1 можно определить концентрацию ЦП в пробе - 0,057 + 0,005 мг/мл.

Для построения калибровочных гра0

5

0

фициент зкстинкции равным 1, хЮ .М см 1

П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, однако реакцию |эстанавливают 83 мкл серной кислоты, конечная концентрация 0,5 М. . .0,480+0,071, оксидазная активность соответственно равна 1,92 ± +0,28 отн.ед/ч. При использовании калибровочного графика, при построе-- НИИ которого реакцию также останавливали добавлением 83 мкл 96%-ной к реакционной смеси, можно определить концентрацию ЦП в пробе.

Данные по определению активности ЦП в сыворотке крови представлены в таблице,

55

Формула изобретения

Способ определения оксидазной активности церулоплазмина путем инкуба313340894

ции образца, содержащего церулоплаз-ности и чуствительности способа,

мин, с субстратом в присутствии буфе-в качестве субстрата используют

ра с последующей остановкой реакциио-фенилендиамин, а в качестве

ингибирующим агентом и спектрофото-ингибирующего агента серную кисметрированием, отличаю щийглоту в конечной концентрации 0,3с я тем, что, с целью повышения точ-- 0,6 М.

Концентрация ЦП в сыворотке здоровых людей, определенная с noi мощью предлагаемого способа.

Концентрация ЦП, мг/100 мл

15,59±0,70 19,48+0,84 17,30±0,50 15,70+0,61 17,69+0,41

Редактор А. Огар

Заказ 3959/43Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета- СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.

Относительная оОМбка, %

5,0 А,3 2;9 3,4 2,3

Составитель Н, Гуляева

Техред И.Попович Корректор Л, Пилипенко

Для повышения точности и чувствительности способа к пробе, содержащей церулоплазмин, дЬбавляют раствор о-фенилендиамина. Проводят реакцию при 37 С, затем добавляют ингиби- рующий агент - 96%-ную серную кислоту до конечной концентрации 0,3 - 0,6М. Через 5 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм и рассчитывают активность церулоплазмина. to 4 00 ;о