Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к тиреотропному гормону человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/20 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения тиреотроп- ного гормона (ТТГ) человека методами им- муноанализов.

Цель изобретения - получение штамма, продуцирующего монАТ, не уступающие по специфичности прототипу.

Штамм Т-7, № ВСКК(П) 366(Д) получают следующим образом.

Гибридому получают путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных человеческим ТТГ с миеломными клетками

линии Х63 Ад8653 мыши. Для иммунизации используют самок линии BAIB/c. Иммунизация осуществляется путем трехкратного введения в брюшную полость с интервалом в 13 дней нитроцеллюлозного фильтра с нанесенным ТТГ в количестве 0,5 мкг. Контроль за ходом иммунизации осуществляют путем отбора крови и проверки наличия антител с ТТГ с помощью ИФА. Гибридизацию клеток проводят с помощью ПЭГ (м,в. 4000). Соотношение спленоцитов и миеломных клеток 5:1. После слияния клетки переносят в селективную среду ГАТ (гипоксантин-амиON00 СЯ О

О

ноптеринтимидин) и культивируют до появления клонов в полной среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 5% оленьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 5x10 М 2-меркаптоэтанола, 10 4 М гипоксантина, 4 х М аминоптери- на и 1,6x10 М тимидина.

Специфичность гибридомных антител определяют методом твердофазного имму- ноферментного анализа (ИФА).

Для проведения ИФА 96-луночные пластины для микротитрования из поливинилх- лорида (ПВХ) покрывают растворами гормонов ТТГ, фолликулостимулирующим (ФСГ), лютенизирующим (ЛГ). соматотроп- ным (СТГ) и хориогонадотропным (ХГ) в кар- бонатно-бикарбонатном буфере 0,05 М, рН 9,6, по 50 мкл на лунку и инкубируют в течение ночи при 4°С или при 37°С 1 ч. Затем лунки пластин блокируют 0,5%-ным раствором желатина в ЗФР при 37°С в течение 40 мин с последующим промыванием раствором ЗФР 0,05% твин-20, Суперна- танты гибридомных культур вносят в лунки пластин, покрытых гормонами. В качестве положительного контроля используют мышиную антисыворотку (разведение 1:10000), а в качестве отрицательного - су- пернатант миеломы РЗ-Х63. Ад8653. После инкубации в течение 1 ч при 37°С пластины трижды промывают ЗФР/твин-20 и добавляют высокоспецифические антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, и инкубируют пластины еще 40 мин при 37°С. После трехкратного промывания пластин ЗФР/твин-20 в лунки добавляют 0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в 0,2 М фосфат- но-цитратном буфере рН 5,0 с добавлением 0,012%-ной перекиси водорода. После появления окраски в лунках реакцию останавливают раствором 2н. серной кислоты. Спектрофотометрическое определение реакции проводят при 492 нм. Из результатов следует, что монАТ Т-7 специфичны только к тиреотропному гормону. Культуры гибридом, в супернатантах которых обнаружены антитела против ТТГ, не реагирующие с ФСГ, ХГЧб, СТГ и ЛГ человека, клонируют методом предельных разведений из расчета 0,3 клетки на лунку в среде RPMi 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 2-меркаптоэтанола в присутствии гипоксантина (10 ч М) и тимидина (1,).

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства. Клетки культивируют в мочослое в концентрации 5x10 10 кл/мл, время субкультивирования около 4В ч

Криоконсервирование. Криоконсерви- рование гибридомы Т-7 проводят в ЭТС, содержащей 15% DMCO. Первые 3 суг ампулы с клетками хранят при -70°С, затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность гибридом оценивают путем подсчета клеток при окрашивании их 0,5%-ным р аствором

0 трипанового синего. Жизнеспособность около 80%.

Характеристика моноклональных антител.

Изотип тяжелой и легкой цепи опреде5 ляют методом прямого иммуноферментно- го анализа с использованием в качестве проявляющих агентов конъюгатов изотип- специфических антител. МонАТ серии Т-1 имеют легкие цепи типа К, изотип тяжелой

0 цепи - гамма 1. Штамм способен расти в организме сингенных мышей в виде асцит- ной опухоли

Для производства асцитов мышей линии BALB/c с самок 12-14-недельного воз5 раста примируют пристаном по 0,5 мл внутрибрюшинноза 10 дней до прививки им клеток гибридом. Клетки гибридом, отмытые средой RPMi 1640, вводят внутрибрю- шинно по 2x10 клеток на мышь Время

0 образования асцитов 14-20 дн. концентрация монАТ 2-10 мг/мл.

Выделение моноклональных антител проводят из асцитной жидкости с помощью фракционирования сульфатом аммония и

5 последующей хроматографии на DEAE-цел- люлозе. Гомогенность выделенных моноклональных антител проверяют с помощью электрофореза в полиакрила- мидном геле в присутствии додецилсуль0 фата натрия. Для доказательства моноклональной природы антител применяют метод аналитического изо- электрофокусирования в тонком слое по- пиакриламидного геля. Установлено, что

5 все антитела серии Т-7 являются продуктами отдельных клонов клеток и выделяются на электрофореграммах в виде набора близко расположенных полос с изо- электрическими точками в диапазонах

0 рН 6,7-8,0.

Полученный штамм гибридных культивируемых клеток Т-7 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюз5 ной коллекции клеточных культур под номером ВСКК (П) 366Д.

Пример. Определение ТТГ человека с помощью монАТ Т-7. Моноклональные антитела Т-7 сорбируют на микротитро- РЗЛЬНЫХ плейтах в дистиллированной воде

(рН 4,7) с концентрацией 40 мкг/мл. Затем в лунки вносят по 100 мл ЗФР, содержащего 0,5% желатина, и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем в лунки вносят по 50 мл стандартов, содержащих известное количество ТТГ (100. 50и25мМЕ/мл). После инкубации в течение 1 ч в лунки вносят по 50 мл кроличьих поли- клональных антител, специфичных к ТТГ че- ловека, в 0,2%-ном растворе ЗФР/желатина в концентрации 10 мкг/мл и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем в лунки добавляют конъюгат высокоспецифических антител козла к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена в 0,2%-ном растворе желатина в ЗФР. Пластины инкубируют 40 мин и добавляют субстрат для ферментативной реакции (о-фенилендиамин в фос- фатцитратном буфере, содержащем 0.012% перекиси водорода). После развития окра0

5

ски (20 мин при 20°С) реакцию останавливают путем добавления в лунки 2N раствора серной кислоты. Оценку реакции проводят с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при 492 нм. По полученным значениям оптической плотности построены калибровочные кривые. Аффинность монАТ оказалась достаточной для создания им- муноферментной тест-системы для определения концентрации ТТГ в диапазоне 0,4-50 мМЕ/мл в биологических жидкостях человека.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток № ВСКК 366Д животных Mys musculus L - продуцентмоноклональных антител к тире- отропному гормону человека.

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и м.б. использовано для количественного определения тиреотроп- ного гормона человека (ТТГ) методами иммуноанализов. Цель изобретения - получение штамма гибридомных клеток мыши, продуцирующего монАТ, специфичные к ТТГ и не дающие перекрестных реакций с другими гормонами гипофиза: ФСГ, ЛГ, СТГ и ХГЧ. Отбор монАТ на специфичность проводили методом твердофазного иммуно- ферментного анализа. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2тМ L-глутами- на и 5-10 М 2-меркаптоэтанола. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей в виде асцитных опухолей. МонАТ принадлежат к субклассу IgGI. Очищенные монАТ используют в качестве 1-го слоя на твердой фазе и ИФА на ТТГ. В качестве 2-х антител (сверху) используют антисыворотку кролика против ТТГ. Такая тест-система позволяет определять ТТГ в диапазоне 0,4-50 мМЕ/мл. Штамм депонирован под № ВСКК (П)366Д. (А С