Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый для получения высокоспецифичных моноклональных антител к тиреотропному гормону человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

У

Ј

Использование: количественное определение тиреотропного гормона человека (ТТГ) в биологических жидкостях с диагностической целью. Сущность изобретения: предложен штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, используемый для получения моноклональных антител (МКА) к / -субъединице ТТГ. Концентрация МКА в культуоальной жидкости составляет 70 мкг/мл, в асцитной 5-7 мг/мл. 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения содержания тиреотропного гормона ЛТГ) человека в биологических жидкостях с целью диагностики гипотиреоза новорожденных и для дифференциальной диагностики гипер- и эутиреоза.

Известны штаммы гибридных клеток, используемые для получения моноклональных антител к ТТГ человека.

Однако данные антитела перекрестно реагируют с другими родственными гормонами гликопротеиновой природы (лютеини- зирующий(ЛГ) и фолликулостимулирующий (ФСГ) гормоны человека).

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующего моноклональ- ные антитела (МКА) высокой специфичности по отношению к ТТГ человека и не дающие

перекрестных иммунологических реакций с ЛГ и ФСГ человека.

На чертеже представлен график калибровочной кривой исследования ферментативной активности штамма.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BaLB/c иммунизируют человеческим ТТГ путем трехкратного введения с интервалом в 13 дней в брюшную полость нитроцеллюлозного фильтра, на который нанесено 0,5 мкг ТТГ человека. После иммунизации у животных стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию сплено- цитов. Гибридизацию проводят путем слияния спленоцитов с клетками мышиной миеломы X 63.Ад.653 с помощью 5,%-ного полиэтиленгликоля мол.массы 4000. Соотношение клеток селезенки и клеток миеломы составляет 5:1. После гибридизации клетки высеивают в 24-луночные планшеты

по 5x10 кл на каждую лунку, селекцию проводят на среде ГАТТ, содержащей 5% оленьей сыворотки. Для поддержания роста гибридных клеток в каждую лунку предварительно высевают перитонеальные макрофаги мыши (5x104 кл. на лунку). Культура ль ну ю жидкость из лунок с растущими клонами тестируют на наличие антител, специфичных к /J -субъединице ТТГ человека путем иммуноферментного анализа. В качестве антигена используют гормоны аденогипо- физа: соматотропный гормон (СТГ), Л Г, ФСГ человека, а также хорионический гонадот- ропин быка. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к ТТГ и не дающие перекрестных реакций с ФСГ, Л Г, СТГ и хорионическим гонадотропином быка, клонируют методом предельных разведений (1 кл на 3 лунки) в среде RPM1 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 200 мМ глутамина, М 2- меркаптоэтанола, 10 М гипоксантина и 1, М тимидина. Затем гибридный штамм, стабильно продуцирующий МКА, используют для наработки антител при культивировании In vitro и in vivo.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен Т-32. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номером 448 Д и характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки.

Стандартные условия выращивания: среда RPM1 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5x10 М 2- меркаптоэтанола, температура культивирования 37°С; газовая фаза - воздух +5% С02. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5x105-10 кл/мл, время субкультивирования 2-3 дн.

Для получения асцита мышей линии BaLB/c самок 12 - 14-недельного возраста обрабатывают пристаном по 0,5 мл внутри- брюшинно за 10 дн до прививки гибридных клеток. Клетки гибридом, отмытые средой RPM1 1640, вводят внутрибрюшинно по 2х106 кл. на мышь. Время образования асцита 14 - 20 дн.

Данные видовой принадлежности: мышиные клетки BaL в/с.

Продукция МКА стабильна на протяжении 25 пассажей в культуре и 5 пассажей на животных.

Характеристика целевого продукта.

Штамм гибридных клеток Т-32 продуцирует моноклональные антитела подкласса GI, высокоспецифичные к ТТГ человека Специфичность оценивают иммунофермен- тным методом. МКА не реагируют с Л Г ФСГ

и СТГ человека и с хорионическим гонадотропином быка

Способ криоконсервации:кориоконсер- вирование гибридомы Т-32 проводят в ЭТС,

содержащей 15% ДМСО. Первые 3-е суток ампулы с клетками хранят при - 70°С, затем переносят в жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания составляет около 40%. Оценку жизнеспособности проводят путем подсчета клеток при их окрашивании 0,5%-ным раствором трипанового синего.

П р и м е р 1. Определение специфичности МКА Т-32.

МКА против ТТГ человека получены из асцитной жидкости мышей линии BaLB/c, Из 1 мм асцита с помощью ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ целлюлозой выделено 5 мг антител к ТТГ человека. Для

проверки специфичности моноклональных антител Т-32 исследуют их способность связывать родственные гормоны аденогипо- физа человека (ЛГ и ФСГ), а также хорионический гонадотропин быка. ТТГ, Л Г,

ФСГ, а также хорионический гонадопропин человека и быка имеют общую а -цепь, а уЗ-цепи содержат аминокислотные последовательности, индивидуальные для каждого гормона. Поэтому отсутствие перекрестной

реакции МКА Т-32 с Л Г, ФСГ человека и хорионическим гонадотропином быка при одновременном проведении ИФА с перечисленными гормонами является доказательством высокой специфичности МКА

Т-32 по отношению к ТТГ человека и позволяет предположить, что указанные антитела скорее всего направлены к /5-субъединице гормона.

96-луночные планшеты инкубируют 1 ч

при 37°С с растворами ЛГ, ФСГ человека и хорионическим гормоном быка в концентрации 1 мкг/мл в карбонат - бикарбонатном буфере 0,05 М, рН 9,6. Затем планшеты инкубируют с 0,5%-ным раствором желатины

в течение 1 ч при 37°С. После промывания 20 мМ фосфатным буфером с 0,05.% Твин-20 в лунки вносят МКА (разведение 1:50000) и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем лунки обрабатывают кроличьими антителами против

иммуноглобулинов мыши, конъюгирован- ных с пероксидазой хрена. После трехкратного промывания планшетов фосфаты буфером с Твин-20 в лунки добавляют 0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в

0,2 М фосфатно-цитратном буфере (рН 5,0) с добавлением 0,012% перекиси водорода. После появления окраски реакцию в лунках останавливают раствором 2 М серной кислоты и проводят регистрацию ферментативной активности. МКА против ТТГ человека реагируют только с ТТГ человека и не реагируют с ЛГ, ФСГ человека и хорионическим гонадотропином быка. Из результатов анализа следует, что МКА Т-32 высокоспеци- фичны по отношению к ТТГ человека и скорее всего направлены к его ft -субъединице.

Данные определения специфичности МКА Т-32 к ТТГ человека приведены в таб- лице.

П р и м е р 2. Использование МКА серии Т-32 при определении ТТГ человека с помощью ИФА.

Для исследования возможности ис- пользования МКА Т-32 для определения ТТГ в сыворотке крови человека антитела сорбируют на микротитровальных планшетах в дистиллированной воде (рН 7,4) с концентрацией 20 - 40 мкг/мл. Затем в лунки вносят по 100 мл фосфатного буфера, содержащего 0,5% желатина, и инкубируют 1 ч при 37°С. Планшеты промывают. Затем в лунки вносят известные концентрации гормона (100, 50, 25 мМЕ/мя), предварительно растворен- ного в сыворотке здоровых людей (содержание ТТГ 0-1 мМЕ/мл). После инкубации 1 ч при 37°С планшеты отмывают и добавляют в лунки по 50 мл кроличьих поликлональ- ных антител, специфичных к ТТГ человека,

в концентрации 10 мкг/мл в фосфатном буфере, содержащем 0.2% желатин. Инкубируют 1 ч при 37°С, планшеты тщательно промывают и добавляют в лунки коньюгат высокоспецифических антител козла к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена в 0,2%-ном растворе желатины в фосфатном буфере. Планшеты инкубируют 1,5 ч при 37°С, промывают и добавляют субстрат для развития ферментативной реакции (о- фенилендиамин в Na-цитратфосфатном буфере, содержащем 0,012% перекиси водорода). Через 20 - 30 мин после развития окраски реакцию останавливают, добавляя в лунки 10%-ную серную кислоту и проводят регистрацию ферментативной активности при 492 нм. По полученным значениям оптической плотности строят калибровочные кривые, по которым видно, что аффинность МКА Т-32 достаточна для создания иммуно- ферментной тест-системы для определения ТТГ в диапазоне от 2,4 до 50 мМЕ/мл в биологических жидкостях человека.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscuius L. ВСКК(П) N 448Д, используемый для получения высокоспецифичных, моноклональных антител к тиреот- ропному гормону человека.

1

«Ч

О) «3Va

го