Иммуноферментный способ определения миоглобина в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени .разрушения мышечных клеток.

Целью изобретения является повыше- ние точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Очищенными антителами к миоглобнну в концентрации 7.1 мг/мл при рЯ 9,6 в объеме 3- мкл : t.iudiov гл;.лг. гиро- ловый планшет япя иммунологических реакций при 4°С п течение 18 ч. Одновременно обрабатывают миоглобин-стандарт и пробу крови формальдегидом. Для этого к ЗОТ мкл миоглобина-стан- дарта с концентрацией 1 мг/мл добавляют 30 мкл 3%-ного раствора Лормаль- дегида и смесь инкубируют в течение 1 ч при 30 С. После этого смесь подвергают диализу против 0,05 М ного буфера рН 7,2 в течение 40- 60 мин при перемешивании и частой смене диализируюцего раствора. Диалогичным образом к 300 мкл предварительно разведенной в 10 рач платмы кроим добавляют 30 мкл 3%-ного РЯС вора Формальдегида и сме.ь инкубируют в течение 1 ч при 30°С. После этого смесь диапиз-уют против фосфатного

|

о i

СЛ Јь

3

буфера рН 7,2. Приготовленный таким образом миоглобнн-стандарт используют для построения калибровочной кри- , вой, а пробу - для иммуноферментного определения уровня мкоглобина.

Пример 1. В лунки планшета, содержащие антитела к многлобину, добавляют обработанный формальдегидом миоглобинсодеряащий раствор плазмы крови пациента в объеме 50 мкл на лунку и инкубируют в течение ДО мин при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают 350 мкл раствора казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фос- фатном буфере рН 7,2 в течение 3 мин.. После этого в каддую лунку добавляют по 50 мкл разведенных 1:500 меченых пероксидазой антител к миоглобину человека и инкубируют в течение 40 мин при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина с концентрацией 0,5 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2 в течение 3 мин. Определяют пероксидазную активность по общепринятой методике в присутствии хромогена 0-фенилендиамина. Время экспозиции составляет 20 мян, а после остановки ферментативной реакции 50%-ной серной кислотой.измеряют ОПТИ ческую плотность при 492 нм. По ре- :эультатам оптической плотности растворов-стандартов строят калибровочную кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови.

Пример 2. Анализ уровня миоглобина в цельной кропи и пробе сыворотки крови пациента проводят по при

-

15 2025JQ ботки 35

75414

тимальной и однозначной концентрацией казеина является 0,5 мг/мл, о чем свидетельствует наиболее низкая оптическая плотность раствора в холостом опыте.

Показано, что значения коэффициента вариации, характеризующего точность метода, рассчитанные для каждой определяемой концентрации миоглобина, для предлагаемого способа значительно меньше, чем для прототипного. Это указывает на более высокую точность предлагаемого способа. Более наглядно это видно из соотношения значений этого коэффициента прототипа/CV предлагаемого) для каждой определяемой концентрации. Это соотношение лежит в пределах 2,55 - 13,31. Среднее значение соотношения составляет 7,651:4,09. Это говорит о том, что предлагаемым способом можно определить уровень миоглобина с точностью, более чем в 7 раз. превышающей точность известного способа.

Оптимальность предлагаемых параметров способа - концентрации Аормаль- дегида 3 мг/мл, времени обработки Формальдегида 1 ч, температуры обра- иллюстрируют -табл. 1-4.

30°С ботки

Формула изобретения

Иммуноферментный способ определения миоглобина в крови, включающий сорбцию антител к миоглобину на твердую фазу, инкубацию с исследуемой пробой крови, добавление меченых пе- роксидаэой антител к миоглобину, от

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и но-, жет быть использовано а кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики степени разрушения мышечных клеток. Цель изобретения заключается в повышении точности иммунобер- ментного способа определения мио гло- бииа з крови. Сущность изобретения состоит в том, что при иммунсЛермент- ном анализе исследуемую пробу плазмы, сыворотки или цельной крови предвари- Тельнд смешивают с раствором Формаль- дегида до его конечной концентрации 3 Мкг/мл и инкубируют в течение 1 ч при 30 С, диалИзуют и добавляют к сорбированным на твердой фазе антителам к ммуноглобулину. Отмывку твррдой фазы после каждой операции осуществляют раствором казеина концентрацией 0,5 мг/мл. Предлагаемый способ поэ ио- ляет повысить точность определения миоглобина в 7 раз по сравнению с прототипом. 4 табл. Ј с

меру 1. По результатам анализа уровень40 мывку после каидой стадии, внесение

миоглобина в цельной крови и пробе сыворотки крови составляет 37,9± ±0,9 нг/мл и 38,1Ј1,0 нг/мл.

Для доказательства оптимальности концентрации казеина в промывочном растворе (0,5 мг/мл) используют ре- эультаты измерений холостого опыта. Этот опыт представляет собой измерение оптической плотности окрашенного раствора в результате проведения им- муноЛерментного анализа в отсутствии миоглобина. Из табл. 4 видно, что опсубстрата пероксидазной реакции и регистрацию изменения оптической плотности раствора, отличаю щий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу

предварительно смешивают с растиором формальдегида до его конечной концентрации 3 мг/мл и инкубируют в течение 1 ч при 30 С, диализуют и добавляют

к сорбированным на твердой фазе антителам к миоглобнну, а отмывку твердой фазы осуществляют раствором казеина с концентра иен 0,5 мг/мл.

формл

Таблица 1

Оптическая плотность раствора при 49Г. нм для концентрации миоглобина 80 нг/мл, отн.ед.

0,68

0,97

1,16

0,84

0,86

0,78

Т а б л и ц л 3

Оптическая плотность раствора при 49Л нм для концентрации миоглобина 80 нг/мл, отн. ед.

,53 ,51 ,54 ,85 ,60

,38

Таблица2

Таблица

Концентрация -казеина, в промывочном растворе,- мг/мл

Оптическая плотность раствора в холостом oiTbtve при 492 нм, отн.ед.

0

М

о,з

0,5 0,7 0,9

0,45

0,31

0,20

0,19

0,19