Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/66 

Изобретение относится к способам- определения количества биологически активных органических соединений и может быть применено в аналитической химии, биохимии, физиологии, в сельском хозяйстве для анализа феромонов спиртовой природы насекомых.

Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повышение чувствительности.

Способ заключается в том, что го- .товят смесь следующего состава в 0,1 М фосфатном буфере, pti 7,8-8,1 (конечные концентрации): 10 - IО М

3, j495382

алкогольдегидрогеназы, 5- 10 - 1СГ М никотинамилалениндинуклеотида, раствор исследуемого спирта. Смесь инкубируют 4-5 мин при комнатной температуре, затем добавляют 0,005 - 0,001 мг/мп очищенной бактериальной люциферазы Benekea harveyi 2,5

флавинмононуклеотида и непосредственно перед измерением вводят М дитионита натрия. Конечный объем смеси составляет 0,5-0,6 мл. Затем измеряют уровень биолюминесценции сме си, по которому,с помощью калибровочной кривой определяют количество исследуемого спирта.

Предпагаемый способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярньк , спиртов, так как детекция ведется не по образовавшемуся в результате реакции НАДН, а по высокомолекулярному альдегиду, чувствительн ость к которому бактериальной люциферазы очень высока.

Предпагаемый способ позволяет определять количество высокомолекулярных спиртов, включая непредельные, от деканола до гексадеканола, что неПример 1. Берут слеклян- ньй стаканчик, снабженный мешалкой, и в нем готовят смесь следующего состава в О,1 М фосфатном буфере, рН 7,9 (конечные концентрации): ЮМ алкогольдегидрогеназы (АДГ) с активностью 25 ед/мг, 510 М никотин- амидадениндинуклеотида (НАД). В to смесь вносят 0,01 мл раствора доде- канола и инкубируют при комнатной температуре и перемешивании 4 мин. Затем в реакционную смесь добавляют 0,005 мг/мл очищенной бактериальной 15 люциферазы В. harveyi с удельной активностью 75 мВ/мг по дитиониту натрия, 2-10 М флавинмононуклеотида (ФМН) и непосредственно перед измерением вводят 210 М дитионита натрия. 20 Конечньй объем смеси составляет 0,5 мл.

Стаканчик помещают в кюветное отделение фотометра с детектором света и значение интенсивности биолюминес- 25 ценции (Ig) определяют по второй i вспьшке, которое выражают в милливольтах (мВ). Полученное значение 1д с учетом поправочного коэффициента на ингибирование (к) и за вычетом

возможно с помощью известного cnoco i 30 фонового свечения (Im) используют для

ба.

Пороговая чувствительность привег дена в таблице.

определения концентрации додеканола в пробе по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кри- рой используют 10 М раствор додека- нола в этаноле, разбавленньй водой в 10 Пример 1. Берут слеклян- ньй стаканчик, снабженный мешалкой, и в нем готовят смесь следующего состава в О,1 М фосфатном буфере, рН 7,9 (конечные концентрации): ЮМ алкогольдегидрогеназы (АДГ) с активностью 25 ед/мг, 510 М никотин- амидадениндинуклеотида (НАД). В смесь вносят 0,01 мл раствора доде- канола и инкубируют при комнатной температуре и перемешивании 4 мин. Затем в реакционную смесь добавляют 0,005 мг/мл очищенной бактериальной люциферазы В. harveyi с удельной активностью 75 мВ/мг по дитиониту натрия, 2-10 М флавинмононуклеотида (ФМН) и непосредственно перед измерением вводят 210 М дитионита натрия. Конечньй объем смеси составляет 0,5 мл.

Стаканчик помещают в кюветное отделение фотометра с детектором света и значение интенсивности биолюминес- ценции (Ig) определяют по второй вспьшке, которое выражают в милливольтах (мВ). Полученное значение 1д с учетом поправочного коэффициента на ингибирование (к) и за вычетом

определения концентрации додеканола в пробе по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кри- рой используют 10 М раствор додека- нола в этаноле, разбавленньй водой в 10 10® раз.

Изобретение относится к способам определения количества биологически активных органических соединений и может быть применено в аналитической химии, биохимии, физиологии, в сельском хозяйстве для анализа феромонов спиртовой природы, микробиологии. Целью изобретения является расширение разрешающей способности способа, повышение чувствительности. Предложенный способ является принципиально новым подходом к определению количества высокомолекулярных спиртов, т.к. детекция ведется по образовавшемуся в результате реакции алкогольдегидрогеназы со спиртом длинноцепочечному альдегиду, чувствительность к которому бактериальной люциферазы чрезвычайно высока. Способ заключается в том, что раствор исследуемого спирта инкубируют в буферной среде с алкогольдегидрогеназой в присутствии никотинамидадениндинуклеотида, а затем в реакционную среду вводят очищенную бактериальную люциферазу B.HARVEYI, флавинмононуклеотид и дитионит натрия. Измеряют уровень биолюминесценции смеси, по которому судят о количестве исследуемого спирта. Чувствительность предлагаемого способа составляет 10^-13-10^-11 моль для спиртов от деканола до гексадеканола. 1 табл.

Из таблицы видно, что пороговая чувствительность предлагаемого способа в 10 раз выше по сравнению с известным (для деканола).

5

Калибровочную кривую строят с учетом эффекта ингибирования люциферазы додеканолом, вводя поправочные коэффициенты, начиная с 10 М концеитра--, ции додеканола, полученные при измерении интенсивности свечения смеси при отсутствии алкогольдегидрогеназы. Кроме того, из полученного значения интенсивности вычитают фоновое свечение, измеряемое при отсутствии в смеси додеканола.

Диапазон линейности калибровочной кривой в координатах Ig ul/lg С для додеканола составляет - 10 М.

Например, если 1 0,8 мВ при I 0,7 мВ и к 1, то получают концентрацию додеканола в пробе, равную

.

Пример 2. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут тетрадеканол. Например, если 1 а 0,9 NiB при Хф 0,75 мВ и к 1,

то получают концентрацию тетрадекано- ла в пробе, равную 10 М,

Диапазон линейности калибровочной

кривой 10 .

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 10 М.

Пример 3. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут цис-6-гексадеценол. Например, если Ig 0,85 мВ при Ijn 0,7 мВ и к 1,

.

то получают концентрацию в пробе, равную 10 М.

Диапазон линейности калибровочной кривой .

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х X .

Пример 4. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут реагенты в следую.щих соотношениях: АДГ, НАД, 0,0 мг/мп лю- циферазы, 5 10 МФМН, дитио- нита натрия в 0,1 М фосфатном буфере, рН 8,1. Конечный объем смеси состав- ляет 0,6 мл.

Диапазон линейности калибровочной кривой для деканола Например, если 1 7,0 мВ при

то получают кон- равную

1 6,2 мВ и к 1, центрацию деканола в Пробе 10 М.

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х X 10 М.

Пример 5. Все операции проводят аналогично примеру 4, но берут. цис-11-гексадеценол. Например, если IQ 7,6 мВ при I 6,3 мВ и

равно

М

к 1,1,то Ig с учетом к 8,4 мВ, что соответствует концентрации в пробе.

Диапазон линейности калибровочной кривой .

Ингибирование и введение поправочных коэффициентов начинается с 5 х X .

Пример 6, Все операции проводят аналогично примеру I, но берут реагенты в следующих соотношениях: АДГ, НАД, 0,001 мг/мл люцеферазы, 2 ФМН, 2 ди- тионита натрия в О,1 М фосфатном бу- фере, рН 7,5. Конечный объем смеси составляет 0,5 мл.

Например, если при определении додеканола 1 0,2 мВ при 1 0,2 мВ и к 1, то превыпения над

0

5

0 5

0

5

0

5

0

фоном не наблюдается и додеканол не определяется.

Выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону уменьшения приводит к невозможности определения спиртов.

Пример 7. Все операции проводят аналогично примеру 1, но берут реагенты в следующих соотношениях: , 5 НАД, 0,05 мг/мл люциферазы, 5.1(, 3-10 мди- тионита натрия в О,I М фосфатном буфере, рН 8,0. Конечный объем смеси сост бляет 0,6 МП.

Например, если при определении тетрадеканола IQ 17,6 мВ при 17,4мВик 1,то получают концентрацию равную 10 М.

Выход за диапазон оптимальных концентраций реагентов в сторону увеличения приводит к ухудшению чувствительности способа.

Использование предпагаемого способа имеет следующие преимущества перед известными способами, подобного рода: возможность определения количества насыщенных и ненасыщенных спиртов от деканола до гексадеканола, повьшенная чувствительность способа.

Формула изоб.ретения

Способ определения количества высокомолекулярных спиртов в растворе, включающий приготовление -реакционной смеси в фосфатном буфере, содержащей алкогольдегидрогеназу, никотинамйла- лениндинуклеотид и раствор исследуемого спирта, определение скорости ферментативной реакции физико-химическим методом с последующей оценкой количества исследуемого спирта, о т- личающийся тем, что, с целью расширения разрешающей способности и повьшения чувствительности способа, в реакционную смесь допол- . нительно вводят 0,005-0,001 мг/мл очищенной бактериальной люциферазы

5

10- Benekea harveyi, 2 винмононуклеотида, 2 дитионита натрия, а скорость ферментативной реакции определяют по уровню биолюминисценции смеси, по которой при помощи калибровочной кривой проводят оценку количества исследуемого спирта.