Способ определения специфического аллергена при атопической бронхиальной астме Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицин и может быть использовано для диаг;- ностики атонической бронхиальной астмы.

Цель изобретения - повьшение точности способа за счет определения аллергена в составе циркулирующих иммунных комплексов на мононуклеар- ных клетках методом люминолэависи- мой хемилюминесценции клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят среду для измерения хеми- люминесцендии, содержащую, мМ: NaCl 110; трис-HCl 10; глюкозу 7,65; MgCl 2,5 и люминол 0,65. Последний добавляют в среду для усиления хемилюминесценции.

Готовят исследуемый аллерген пу- тем разведения ст андартных растворов коммерческих пылевых и пыльцевых аллергенов в 5%-ном растворе, глюкозы в соотношении 1:1000. Конечная концентрация пыльцевых аллергенов 5рми/мл, пьшевых аллергенов ЮрШ/мл

Выделяют мононуклеарные клетки из гепаринизированной крови больного (5 мл крови, 0,1 гепарина) центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла-верографина плотностью 1,077 г/см при 400 g в течение 40 мин с последующим трехкратным отмыванием средой № 199 по 10 мин. Конечная концентрация клеток составляет (1,5-2,0 х10 .

Получают сыворотку больного из 5 мл негепаринизированной крови центрифугированием при 200 g в течение 1 О мин.

Формируют иммунные комплексы путе .добавления в 100 мкл сыворотки больного 20 мкл разведенного аллергена.

Измеряют хемилюминесценцию в 50 мк суспензии мононуклеарных клеток больного при -введении ее в измерительную кювету прибора, содержащую 800 мкл среды. После достижения максимума спонтанной хемилюминесценции и выхода кривой интенсивности свечения на плато в кювету добавляют 20 мкл сыворотки больного с образовавшимися иммунными комплексами и определяют максимум интенсивности свечения активированных мононуклеарных клеток.

В качестве контроля проводят измерение хемилюминесценции суспензии мoнoнyклeapньtx клеток того же больного, при добавлении аутологичной сыворотки без аллергена, аллергейа без сыворотки и сыворотки с неспецифическим аллергеном.

При анализе результатов за пороговое значение ХЛ-ответа мононуклеарных клеток, активизированных иммунным комплексом (специфическим аллергеном), принимают увеличение интенсивности

свечения не менее, чем в 3 раза по сравнению с контролем сыворотки с неспецифическим аллергеном, и не менее, чем в 6 раз по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией мононуклеарных клеток больного.

Хемилюминесценцию суспензии мононуклеарных клеток измеряют на люми- нометре LKB-1251 или люминометре Свет.

Пример 1. Больной Д., 22 лет. Диагноз: бронхиальная астма, атопи- ческая форма, 1-я стадия, нестойкая ремиссияi быто.вая аллергияJ обструк- тивная эмфизема легких.

В качестве аллергена использов.али растворы пьшевых аллергенов сер.153 и 175 в разведении 1:1000, конечная концентрация 10рШ/мл. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции 50 мкл

суспензии мононуклеарных клеток больного составила 16,5-17,1 мВ, хемилю- минесценция, индуцированная сывороткой больного с пылевым аллергеном сер. 153, равнялись 36,7 мБ, а с аллергеном сер. 175 повысилась до 134,3 мВ, т.е. в 3,7 раза, превышая уровень спонтанного ХЛ-ответа в 7,9 раз.

Заключение: специфический пылевой аллерген сер. 175, сенсибилизация низкая.

45

Пример 2. Больной Г., 16 лет. Диагноз: бронхиальная астма, атопи- ческая форма, 1-я стадия, обострение; бытовая аллергия.

Использовали растворы пылевых аллергенов сер. 112 и 127 в разведении

50 1:1000, конечная концентрация аллергена 7рШ/мл. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции клеток больного 7,8-7,9 мВ, хемилюминесценция,индуцированная сывороткой больного с

gg пылевым аллергеном сер. 112, равнялась 37,2 мВ с аллергеном сер. 127 . ,. повысилась до 295,0 мВ,т.е. в 7,9 раз, превышая спонтанный ХЛ-ответ клеток в 37,3 раз.

Заключение: специфический аллерген домашней пыли сер. 127, сенсибилизация высокая.

П р и м е р 3. Больной С., 30 лет. Диагноз: бронхиальная астма, атопи- ческая форма, 1-я стадия, легкое течение, стадия нестойкой ремиссии, поллиноз.,

Использовали растворы пыльцевых аллергенов ржи и.травы е;жа при разведении 1:1000 в концентрации 5pNU/мл.

Интенсивность спонтанной хемилюми- несценции клеток больного 6,9-6,9 мВ. Хемилюминесценция, индуцированная сывороткой больного с аллергеном ржи, 32,0 мВ, с аллергеном травы ежа 220,0 mV, т.е. выше, чем в случае с применением аллергена ржи, в 6,87 раз, и вьше спонтанной в 31,.9 раз.

Редактор П. Гереши Заказ 4042/38

Составитель М. Васильев Техред В.Кадар

Тираж 776 ВНИИГИ Государственного дсомитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Заключение: специфический аллерген травы ежа, сенсибилизация высокая. Формула изобретения

Способ определения специфического аллергена при атопической бронхиальной астме путем добавления аллергена к мононуклеарным клеткам крови пациентов с последующим его выявлением, отличающийся тем, -что, с целью повышения точности способа,выявление специфического аллергена вег дут с помощью люминодзависимой хеми- люминесценции по интенсивности свечения до и после добавления сыворотки больного, при этом аллерген берут в концентрации 5-10 pNU/мл при соот- ножении с сывороткой 1:5 и при увеличении стечения в 6 и более раз определяют наличие специфического аллергена.

Корректор И. Муска . Подписное

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Готовят среду для измерения хемилюминесценции и исслед,у- емый аллерген. Из гепаринизированной крови больного выделяют мононуклеар- ные клетки. Измеряют хемилгоминесценцию в суспензии мононуклеарных клеток. После достижения максимума спонтанной хемилюминесценции добавляют сыворотку больного с образовавшимися иммунными комплексами и определяют максимум интенсивности свечения.Для контроля измеряют хемилюминесценцию суспензии мононуклеарных клеток,при добавлении аутологичной сывЬротки без аллергена, аллергена без сыворотки и сыворотки с неспецифическим аллергеном. За пороговое значение хемилю- минесцентного ответа мононуклеарных клеток, активизированных иммунным комплексом, принимают увеличение интенсивности свечения не менее чем в 6 раз по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией и не менее чем в 3 раза по сравнению с контролем (при добавлении сыворотки с неспецифическим аллергеном). (Л 00 со ел 00 00