Способ определения иммунологической реактивности организма Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике специфического клеточного иммунитета, а также установления его типа при острых и хронических заболеваниях инфекционного, аллергического, аутоиммунного, профессионального и др. генеза.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения рецепторного аппарата лимфоцитов и клеток.

Способ осуществляется следующим образом в два этапа.

1-й этап включает наслоение антигена на латекс. К 1 мл суспензии из

частиц латекса в концентрации 10 добавляют 1 мл антигенов (используются стандартные бактериальные, грибковые, пыльцевые, пищевые или производственные антигены, а также тканевые антигены, полученные общепринятым методом.

Смесь латекса и антигена помещают в морозильное отделение холодильника на 18 ч, после чего ее центрифугируют, надосадочную жидкость выливают, добавляют 1 мл физиологического раствора

На 2-м этапе проводят исследование люминолзависимой хемилюминесценции сенсибилизированных лейкоцитов.

Кровь из пальца или вены набирают в 4 гепаринизированные капилляры. Герметически закрытые капилляры центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Лейковзвесь из четырех капилляров, образованную на границе плазма - эритроцит, растворяют в 8 мл раствора Хенкоа образуя 16 проб (2 контрольных и 14 опытных). При необходимости исследовать одновременно большее или меньшее количество антигенов описанным способом готовят нужное количество проб из расчета: 1 капилляр периферической крови, растворенный в 1,5 мл раствора Хенкса на каждые 3 пробы.

Смесь лейковзвеси и раствора Хенкса разливают по 0,5 мл во флаконы для хемилюминесцентного исследования, после чего добавляют: в 1-й контрольный флакон 0,1 мл физиологического раствора,во -й контрольный флакон 0,1 мл раствора частиц латекса в дистиллированной воде в концентрации 101, в 3 - 14-й опытные флаконы по 0,1 мл частиц латекса, нагруженного бактериальными, грибковыми или тканевыми антигенами в конечной концентрации 10 .

В каждую пробу добавляют 0,1 мл 2,8 ММ раствора люминола, пробы инкубируют в термостате 30 мин и проводят замер хемилюминесценции в режиме счета фотонов с помощью ФЭУ-39а

Сопоставляют результаты хемилюминесценции, полученные во 2-й контрольной пробе с опытными, выявляя пробу, хемилюминесцентное свечение которой существенно выше по сравнению со 2-й контрольной, на основании чего диагностируют наличие специфической иммунной реакции по отношению к данному антигену.

Для уточнения напряженности иммунитета, т.е. типа1 иммунологической реакции сопоставляют показатели 1-й и 2-й контрольных проб, диагностируя гипергический тип клеточного иммунитета при отсутствии разницы между показателями спонтанной хемилюминес- ценции и стимулированной .инертным t латексом (неспецифическим стимулятором) , тогда как гиперерический тип иммунной реакции определяют при наличии разницы между этими показателями

П р и м е р 1. Больной К., 7 лет, поступил в детское отделение с диагнозом: левосторонняя очаговосливная

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

бронхопневмония ДН, левосторонний экссудативный плеврит.

Иммунологическое исследование выполнено согласно методике, описанной в предыдущем разделе. У больного из пальца произведен забор крови в 3 гепаринизированные капилляра. Лейковзвесь из капилляров получали описанным способом, растворяли в 6 мл раствора Хенкса, смесь распределяли по 0,5 мл на 12 проб.

Ко всем пробам добавляли 0,1 мл 2,8 ММ люминола, пробы инкубировали в термостате в течение 30 мин и проводили измерение хемилюминесценции каждой пробы в течение 10 с. Получают хемилюминесцентное свечение в 1-й контрольной пробе в течение 12500 имп/с, а во 2-й контрольной пробе - 11950 имп/с.

Значения хемилюминесценции 1-й опытной пробы (стимулированной частицами латекса, нагруженными антигеном гемолитического стафилококка составили 19200 имп/с, что существенно выше по сравнению со второй контрольной пробой. Данные хемилюминесценции других опытных проб достоверно не отличались от 2-й контрольной пробы. На основании полученных данных диагностировано наличие специфической иммунной реакции по отношению к гемолитическому стафилококку. Отсутствие существенной разницы в показателях хемилюминесцентного свечения 1-й и 2-й контрольных проб позволяет определить гипергическую иммунную реакцию к выявленному антигену гемолитического стафилококка. Низкая напряженность иммунитета указывает на активный инфекционно-воспалительный процесс, вызванный стафилококковой инфекцией, что было подтверждено выявлением в плевральной жидкости гемолитического стафилококка в высоких титр ix - 10 .

Полученные данные подтверждены также нарастанием титров антистафилококковых антител в динамике заболевания (через 2 недели от начала болезни титр антистафилококковых антител вырос в 6 раз по сравнению с исходным уровнем.

При исследовании известным способом существенной разницы в показателях спонтанной, стимулированной ФГА и стимулированной гемолитическим стафилококком РБТД не выявлено (процент властных -клеток соответственно

5162

составил: г7%, 17,2% и 18,1Й), в связи с чем определение реактивности специфического клеточного иммунитета было невозможным. Это свидетельствует о преимуществе предлагаемого способа по сравнению с известным, диагностика с помощью которого невозможна при гипергических реакциях иммунитета.

П р и м е р 2. Больная К., 13 лет, поступила в стационар с диагнозом: хроническая пневмония в стадии ремиссии, деформирующий бронхит.

Проведено иммунологическое обсле- дование по предлагаемому способу.Из двух капилляров крови, взятых у больной из пальца приготовлено 6 проб: 1-я контрольная с физиологическим раствором, 2-я контрольная с латек- сом без антигена, 1-я опытная с латексом, нагруженным легочным антигеном, 2-я опытная с латексом, нагруженным стафилококковым антигеном, 3-я опытная с латексом, нагруженным стрептококковым аллергеном, 4-я опытная с латексом, нагруженным комплексным пневмококковым алпергеном, 5-я опытная с латексом, нагруженным аллергеном нейссерия катарралис, 6-я опытная с латексом, нагруженным си- негнойной палочкой, 7-я опытная с латексом, нагруженным туберкулином.

В результате измерения хемилюми- несценции подготовленных проб получены следующие результаты: 1-я контрольная проба 11200 ими/с, 2-я контрольная проба 17020 имп/с. Среди опытных проб повышение хемилюминес- ценции отмечалось в пробах 1-й, Ь-й и 7-й, на основании чего диагностирована специфическая реакция иммунитета по отношению к легочному антигену, антигену нейссерии катарралис и туберкулину. Сопоставление результа- тов исследования 1-й и 2-й контрольной проб позволило установить существенное повышение хемилюминесцентного свечения в 1-й пробе по сравнению со 2-й, что свидетельствует о повышен- ной (гиперергической) реакции иммунитета к данным антигенам, что может быть связано с хроническим инфекционным процессом.

Проведенное обследование позво- лило уточнить окончательньй диагноз: хроническая пневмония, гиперчувствительность замедленного типа в отношении легочного антигена, антигена нейссерия катарралис и туберкулина.

c 0 5 0

Q .

,

5

Установленный диагноз подтвержден путем проведения комплекса иммунологических исследований. Аутоиммунную реакцию на легочной антиген выявлено путем проведения реакции поглощения комплемента (по Кондрашовой И.И.), которая была положительная (+++). Специфичность антигена нейссерия катарралис к туберкулина подтверждена путем постановки кожных проб. Кожная проба с аллергеном нейссерия катарралис была положительна (+++) через 48 ч (отмечался волдырь в диаметре более 12 мм). Проба Манту - папула 19 мм (через 32 ч).

При исследовании известным способом РБТЛ спонтанная составляет 12%, РБТЛ с ФГА - 23%, РБТЛ с аллергеном нейссерия катарралис - 22,6%, РБТЛ с легочным антигеном - 23.6%, РБТЛ г туберкулином - 41,4%, что свидетельствует об отсутствии положительных реакций со специфическими антигенами легких (нейссерия катарралнс): положительная реакция отмечена только в отношении туберкулина.

В приведенном примере высокая точность предлагаемого способа подтверждена комплексом иммунологических исследований, выявляющих наличие специфической сенсибилизации к антигенам различного вида.

В то же время обследование предлагаемым способом не дало положительных реакций к двум из трех специфических антигенов. Это указывает на большую точность предлагаемого способа по сравнению с известным.

П р и м е р 3. Больной В., 36 лет, поступил в кли- ику ВНИИТИНТОКСА с диагнозом: бронхиальная астма, профессионального генеза.

Из проф. анамнеза выяснено, что в течение 11 лет работает аппаратчиком в цеху антибиотиков по производству биомицина на Немешаевском биохимзаводе.

Для подтверждения диагноза необходимо установить наличие сенсибилизации к производственному антигену (биомицину) и выявить напряженность иммунитета по отношению к выявленному специфическому антигену.

Для решения поставленной задачи согласно методике предлагаемого способа создано три пробы: 1-я контрольная нестиммулированная, 2-я контрольная, стимулированная инертным латексом, 3-я опытная, стиммулированная

латексом, нагружённым раствором биомицина в разведении 1:10.

Получены следующие результаты: хемилюминесцентное свечение 1-й контрольной пробы составляет 12950 имп/с, 2-й контрольной пробы - 28732 имп/с, 3-й опытной пробы - 44260 имп/с.

На основании полученных данных, свидетельствующих о существенном повышении хемилюминесценции в пробе, содержащей производственный антиген (биомицин) по сравнению с контролем, а также повышение свечения во 2-й контрольной пробе по сравнению с 1-й контрольной диагностировано наличие сенсибилизации к биомицину и гиперэр- гическую реакцию иммунитета по отновить специфический антиген, но и определить напряженность иммунитета в отношении данного антигена, в плане 5 уточнени гиперерической или гипер- эргической реакции иммунитета, что позволяет также отдифференцировать острый и хронический инфекционный, аллергический или аутоиммунный про- Ю цесс.

Практическая значимость способа определяется широкой информативностью, позволяющей исследовать специфи- , ческие реа-кции иммунитета в отноше- 15 нии самых различных антигенов (инфекционных, тканевых, атонических, производственных, медикаментозных и др.), быстрым получением результатов (через час после взятия крови

шению к этому антигену. Это подтверж- 20 Для исследования), тогда как при ис- дает возможность возникновения хронического заболевания (бронхиальной астмы), вызванного производственным - антигеном.

Диагноз гиперчувствительности замедленного типа, вызванный производственным антигеном (биомицином), подтвержден постановкой реакции торможения миграции лейкоцитов (миграция .лейкоцитов в агарозе, содержащей

25

30

следовании известным способом - только на 5 - 7-е сутки, а также высокой объективностью, поскольку результаты исследований регистрируются печатным устройством установки по измерению хемилюминесценции. Формула изобретения

Способ определения иммунологической реактивности организма путем добавления к лейкоцитам крови больного специфического и неспецифического стимулятора с последующим учетом показателей реакции на стимуляторы и без них, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет определения состояния рецепторного аппарата лимфоцитов.и фагоцитирующих клеток,в качестве стимулятора используют частицы латекса, нагруженные специфическим и неспеци- фическим антигеном, далее проводят реакцию хемилюминесценции и при повышении специфической хемилюминесценции и отсутствии разницы между показателями реакции на неспецифический стимулятор и без него определяют ги-1 пергический тип иммунной реакции, а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной реакций.

биомицин в разведении 1:100 , была

на 20(5% меньше по сравнению с контролем) .

При. постановке РБТЛ (по известно способу) существенной разницы между показателями спонтанной, стимулированной ФГА и стимулированной специфическим антигеном (биомицином) не выявлено, что свидетельствует о большой точности предлагаемого способа по сравнению с известным.

Предлагаемым способом обследован 110 детей с различной соматической и инфекционной патологией, а также более 280 взрослых лиц в отделениях клиник терапевтического профиля, профзаболеваний и туберкулеза. Точность способа при этом возрастала на 62% (по известному 32%).

Преимущества способа заключаютс также в возможности не только выя- Составитель Г Редактор Н.Лазаренко Техред Л.Сердю

вить специфический антиген, но и определить напряженность иммунитета в отношении данного антигена, в плане уточнени гиперерической или гипер- эргической реакции иммунитета, что позволяет также отдифференцировать острый и хронический инфекционный, аллергический или аутоиммунный про- цесс.

Практическая значимость способа определяется широкой информативностью, позволяющей исследовать специфи- ческие реа-кции иммунитета в отноше- нии самых различных антигенов (инфекционных, тканевых, атонических, производственных, медикаментозных и др.), быстрым получением результатов (через час после взятия крови

Для исследования), тогда как при ис-

ва

следовании известным способом - только на 5 - 7-е сутки, а также высокой объективностью, поскольку результаты исследований регистрируются печатным устройством установки по измерению хемилюминесценции. Формула изобретения

Способ определения иммунологической реактивности организма путем добавления к лейкоцитам крови больного специфического и неспецифического стимулятора с последующим учетом показателей реакции на стимуляторы и без них, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет определения состояния рецепторного аппарата лимфоцитов.и фагоцитирующих клеток,в качестве стимулятора используют частицы латекса, нагруженные специфическим и неспеци- фическим антигеном, далее проводят реакцию хемилюминесценции и при повышении специфической хемилюминесценции и отсутствии разницы между показателями реакции на неспецифический стимулятор и без него определяют ги-1 пергический тип иммунной реакции, а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной ре, акций.

Корректор М.Демчик

Изобретение относится к медицине и может найти применение в диагностике спефицического клеточного иммунитета при острых и хронических заболеваниях инфекциошго-аллергического или аутоиммунногогенеза.Цель изобретения - повышение точности за счет определения рецепторного аппарата лимфоцитов и фагоцитов. Производят измерение люмннолзависимой хемолюми- несценции нестнмулироваиных сенсибилизированных лейкоцитов, лейкоцитов, стимулированных латексом без антигена и лейкоцитов, стимулированных латексом, нагруженным бактериальным или тканевым антигеном, сопоставляют полученные данные и при повышении хемилюминесценции в пробе, содержащей специфический стимулятор, и отсутствии разницы между показателями реакции па неспецифический стимулятор и без него определяют гипергический тип иммунной реакции, а при наличии разницы между ними определяют гипергический тип иммунной реакции. Точ- - ность способа составляет 62%, по прототипу - 32%. с « СО