Способ определения в крови гликозилированных соединений,содержащих кетоаминовую связь Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Изобретение относится к медицинской биохимик и может быть использовано в клинико-диагностических исследованиях эндокринологического профиля.

Цель изобретения - повьпление точности и упрощение способа.

Способ осзпцествляется следующим образом. Проводят забор крови, пробу крови гемолизируют водой, добавляют щавелевую кислоту, нагревают, охлаж дают, обрабатывают трихлоруксусной кислотой, отделяют белки, а суперна- тант обрабатывают тиобарбитуровой кислотой. Затем пробы спектрофотомет- рируют, а расчет ведут по калибровочному графику, построенному по фрукто- 3оглицину.

0,7 1,4 2,8 5,6 8,4

0,05 0,09 О,, 17 0,35 0,53

К 1,0 мл цельной крови добавляют 0,9 МП дистиллированной воды и 0,5 мл 1,0 н. щавелевой кислоты и нагревают в течение 4 ч на кипящей водяной бане в запаянных ампулах. После рхлаждершя добавляют 0,5 мл 40%-ной трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируют 10 мин при 7000 об/мин. К 1,0 мл надосадочной жидкости добавляют 0,5 и-т 0,05 м тиобарбитуровой кислоты и инкубируют 30 мин при 40°С. После инкубации измеряют величину абсорбции (А) при 443 нм. Поскольку работа ведется с цельной кровью, необходимо определение фоновых значений А, Определение Фока проводят аналогично указанным операциям, исключая стадию кислотного гидролиза. Расчет колич€;ства гли- козилированного гемоглобина ведется по калибровочному графику.

Концентрацию суммарного гемоглобина в крови определяют по гемогло- бинцианидному методу. По полученной оптической плотности (А А„роеи АфокаПример. Для построения калибровочного графика по фруктозоглицину (ФГ) готовят стандартные растворы,

содержащие 0,7; 1,4j 2,8; 5,6; 8,4;

11,2; 14,0; 16,9; 20,4 моль/л ФГ в пробе соответственно, что соответствует 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 145 мкг в пробе. К пробам, содержащим

по 1,0 m приготовленных растворов, добавляют по 0,5 мл 1,0 н.щавелевой кислоты и нагревают в течение 4 ч на кипящей водяной бане. Затем отбирают по 1,0 мл, добавляют 0,5 мп тиобарбитуровой кислоты и инкубируют 30 мин при 40 .

; Измерение оптической плотности проводят при 443 нм. Результаты измерений приведены в табл.1.

Таблица 1

11,2 14,0 16,9 ,20,4

0,71 0,90 1,07 1,30

35 по стандартному графику Фруктозогли- цин находим концентрацию соединений, содержащих кетоаминовую смесь в пробе, выраженную в виде концентрации фруктозоглицина ().

40 Содержание гликозилированного гемоглобина в пробе определяют по формуле

0

5

5

где С

Сфг 2 CUB

ФГ

100%,

- концентрация к тоаминов в

пробе, моль/л; Сцр - концентрация суммарного .

гемоглобина, моль/л; 2 - коэффИ11 1ент, учитывающий

что одна молекула гемоглобина связана с двумя молекулами фруктозы (молекула гемоглобина имеет две субъединицы, каждая из которых состоит из об -5 -цепей, а гликозилиро- вание протекает только по концевому

валину /3-цепи) . I

В качестве конкретного примера приведено определение содержания гли313

козилированного гемоглобина в крови

.больного диабетом.

В результате гидролиза пробы крови получена оптическая плотность А 0,385; 0,087, А - А

npOSbl

- А

IfOHH

пробы 0,298. По калибровочному графику А О,298 соответствует концентрации соединений, содержащих кетоами- новую связь, выраженную в концентра- ции фруктозоглицина 78 10 моль/л Концентрация суммарного гемоглобина .Cj,g 15,4 г% или 2, моль/л.

Подставляя полученные значения в формулу, получаем содержание глико- зилированного гемоглобина, равное 10%.

В табл.2 представлены данные, подтверждающие возможность определения, наряду с гликозилированным гемоглобином, и других гликозилированных соединений.

Таблица 2

Белки:

0,1 0,15 0,900

0,1 0,15 0,460

Редактор А.Козориз

Составитель Н.Гуляева

Техред А.Кравчук Корректор А.Зимокосов

Заказ 5116/43Тираж 775Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Продолжение табл.2

Фруктозоами-нокислоты:

15

Таким образом, проведение расчета по стандартной кривой Фруктозоглиг цин повышает точность метода в 2,4 раза, переход с эритроцитарной массы на цельную кровь значительно упрощает, проведение анализа.

Формула изобретения

Способ определения в крови глико- лизированных соединений, содержащих кетоаминовую связь, путем отбора кро- ви, добавления к пробе щавелевой кислоты, нагревания, осаждения белков,

центрифугирования, добавления тиобар- битуровой кислоты и инкубации с последующим спектрофотометрированием и расчетом по калибровочной кривой, отличающийся тем, что, с целью повьшения точности и упрощения способа, в качестве биологического материала используют цельную кровь, а в качестве стандарта при построении калибровочной кривой применяют фруктйзоглицин.

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Цельную кровь и щавелевую кислоту нагревают. После охлаждения добавляют три- хлоруксусную кислоту и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют тиобарбитуровую кислоту и инкубируют. Измеряют величину адсорбции и определяют фоновые значения адсорбции. Рас- считьюают количество гликозилирован- ного гемоглобина по калибровочному графику. 2 табл. со 4 «