ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ CNIDIUM MONNIERI (L.) CUSS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО РИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в косметической, парфюмерной, медицинской отраслях промышленности и сельском хозяйстве.

Препараты, обладающие рибонуклеазной активностью, используются в медицине как противовирусный препарат, обладают антимикробным действием, оказывают летальное действие на дрожжи и термофильные бактерии, широко используются как биохимический препарат в молекулярной биологии и генной инженерии.

В настоящее время источниками получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, являются бактериальные и животные клетки. В частности, получены неспецифическая бациллярная РНКаза (препарат "биназа") и панкреатическая рибонуклеаза А (Прикладная биохимия и микробиология, 1991, вып. 27, N 3, с. 308-329).

Так как известные источники получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, полностью не удовлетворяют потребительский спрос, поиск новых доступных и возобновимых источников является актуальной проблемой. Растительные источники получения препаратов, обладающих рибонуклеазной активностью, не известны.

Предлагается штамм Cm-1 культивируемых клеток растений Cnidium monnieri, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.

Травянистое растение Cnidium monnieri (L.) Cuss. (Selinum monnieri L.) - Жгун-корень Моннье распространено в Приморье и Приамурье (Шретер. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока. 1975, с. 328).

Штамм Cnidium monnieri (L.) Cuss. получен и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК (ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 40. Наименование штамма - Cm-1.

Исходным материалом для получения штамма Cm-1 было дикорастущее растение Cnidium monnieri (L.) Cuss., заготовленное в октябре 1987 года в Надеждинском районе Приморского края. Эксплантаты изолированы из стеблей диаметром 3-4 мм.

Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой ткань плотной консистенции, бледно-желтого цвета с зеленоватым оттенком. Ростовой индекс 30 ± 0,5 для каллусов начальной биомассой 200 мг. Живых клеток 90-93% в середине стадии экспоненциального роста, содержание сухого вещества 5,2% . Штамм Cm-1 выращивают при температуре 24 ± 1^оС, относительной влажности воздуха 60 ± 10% в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1500-2300 NH₄NO₃ 350-450 CaCl₂ ˙2H₂O 400-480 MgSO₄ ˙7H₂O 350-400 KH₂PO₄ 150-190 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄ ˙4H₂O 15,6-26,7 CoCl₂ ˙2H₂O 0,02-0,03 CuSO₄ ˙5H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄ ˙7H₂O 6,0-10,3
Na₂MoO₄ ˙2H₂O 0,2-0,3 KI 0,53-0,90 FeSO₄ ˙7H₂O 25,0-30,6 Na₂EDTA ˙2H₂O 33,6-41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидрохлорид 0,45-0,55 Никотиновая кислота 0,45-0,55 Мезо-инозид 80-120 Казеина гидролизат 40-60 6-Бензиламинопурин 0,4-0,6 α-нафтилуксусная кислота 1,5-2,5 Сахароза 25000-35000 Агар 5800-6200
Среда до автоклавирования имеет рН 5,6-5,8.

Ткань культивируется в пробирках размером 30 х 200 мм, содержащих 30 мл среды. Продолжительность цикла выращивания 35 сут, номер пассажа 30-й.

Цитологические и кариологические характеристики штамма Cm-1.

Ткань представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из двух групп клеток. Первая группа - клетки меристематического типа круглой и овальной формы, имеющие средние размеры 65 х 79 мкм, содержание в популяции 57-65% , и клетки паренхимного типа удлиненной формы, имеющие средние размеры 113 х 172 мкм, содержание в популяции 35-43%. Максимумы митотической активности наблюдаются на 6-е и 24-е сут культивирования, митотический индекс 4,6 и 3,8 соответственно.

Культура характеризуется анеуплоидией, увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом (табл. 1).

Характеристика рибонуклеазной активности препарата, полученного из биомассы штамма Cm-1 Cnidium monnieri.

После окончания цикла культивирования (35 сут) биомассу клеток сушат, белки экстрагируют трис-HCl буфером и концентрируют путем дробного высаливания сульфатом аммония.

Полученная белковая фракция представляет собой препарат, обладающий рибонуклеазной активностью.

Рибонуклеазную активность препаратов из биомассы штамма Cm-1 определяют спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата дрожжевую рибонуклеазу.

Препарат, полученный из штамма Cm-1, имеет следующие характеристики, из расчета на 1 г сухих клеток биомассы:
Суммарная рибонуклеазная активность 52610-79990 ед.;
Концентрация белка 179-198 опт. ед.;
Удельная рибонуклеазная активность 270-438 ед./опт. ед.

В табл. 2 приведены характеристики препаратов, полученных из биомассы клеток в процессе долговременного культивирования штамма.

Максимальное накопление рибонуклеазной активности в клетках наблюдается на 35-е сут культивирования. Сухие и сырые (нативные) клетки имеют одинаковую активность.

П р и м е р. В пробирки размером 30 х 200 мм наливают по 30 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: KNO₃ 1900 NH₄NO₃ 400 CaCl₂ ˙2H₂O 440 MgSO₄ ˙7H₂O 370 KH₂PO₄ 170 H₃BO₃ 6,2 MnSO₄ ˙4H₂O 22,3 CoCl ₂˙2H₂O 0,025 CuSO₄ ˙5H₂O 0,025 ZnSO₄ ˙7H₂O 8,6 Na₂MoO₄ ˙2H₂O 0,25
KI 0,83 FeSO₄ ˙7H₂O 27,8 Na₂EDTA ˙2H₂O 37,3 Тиамина гидрохлорид 0,2 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Мезо-инозит 100 Казеина гидролизат 50 6-Бензиламинопурин 0,5 α-нафтилуксусная кислота 2,0 Сахароза 30000 Агар 6000 Среда имеет рН 5,6.

Пробирки со средой стерилизуют при 117^оС в течение 20 мин, затем в асептических условиях в каждую пробирку помещают по 200 мг клеточной биомассы штамма Cm-1. Культивирование проводят в темноте при 24^оС и относительной влажности воздуха 60% в течение 35-ти сут. Затем биомассу снимают с поверхности питательной среды, взвешивают. В каждой пробирке накапливается от 6 до 10 г сырой биомассы. Биомассу сушат при 55^оС в токе горячего воздуха в течение суток. Биомассу экстрагируют трис-HCl буфером, гомогенизируют и выдерживают при температуре 4^оС. Супернатант сливают, а осадок экстрагируют дважды, как указано выше. Из объединенного супернатанта выделяют белковую фракцию путем дробного высаливания сульфатом аммония: объединенный супернатант высаливают первоначально 20% сульфатом аммония, сформированный осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60% насыщения и опять центрифугируют в том же режиме.

Белковая фракция представляет собой препарат, обладающий рибонуклеазной активностью.

Оценка рибонуклеазной активности препарата.

В пробу добавляют 0,5 мл раствора дрожжевой РНК (2 мг/мл), 0,45 мл 0,2 М трис-HCl буфера (рН 6,2) и 0,05 мл исследуемого раствора. Реакционную смесь инкубируют в течение 15 мин при температуре 37^оС. Реакцию останавливают добавлением 2 мл холодного 0,05% спиртового раствора MgCl₂. Для формирования осадка реакционную смесь оставляют на холоде в течение 20 мин. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. В контрольную пробу добавляют все игредиенты, кроме исследуемого раствора.

Активность определяют на спектрофотометре при длине волны 260 нм в пересчете на 1 мл исследуемого раствора фермента. Суммарную активность рассчитывают как произведение активности 1 мл пробы на объем исследуемого раствора.

Концентрацию белка измеряют по поглощению света при длине волны 280 нм, допуская, что 0,1% раствор имеет оптическую плотность, равную единице.

Удельную активность РНКазы определяют путем деления активности данного фермента на его поглощение при длине волны 280 нм и выражают в ед. акт. /опт. ед.

Рибонуклеазная активность всех препаратов определена из расчета на 1 г сухих клеток биомассы штамма Cm-1 (табл. 3, 4).

Таким образом, штамм Cm-1 культивируемых клеток растения Cnidium monnieri является высокопродуктивным и возобновимым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.

Использование: для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью, относится к биотехнологии. Сущность изобретения: каллусный штамм Cm - 1 получен из дикорастущего растения Cnidium monnieri (L.) Cuss., заготовленного в Надеждинском районе Приморского края. Ростовой индекс культуры 3030± 0,50,5. Препарат представляет собой белковую фракцию, выделенную из биомассы клеток штамма Cm - 1, и имеет следующие характеристики (из расчета на 1 г сухих клеток): суммарная рибонуклеазная активность 52610 - 79990 ед. ; концентрация белка 179 - 198 опт.ед.; удельная рибонуклеазная активность 270 - 438 ед./опт.ед. Максимальное накопление рибонуклеазной активности в клетках наблюдается на 35-е сут культивирования. 4 табл.

ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ CNIDIUM MONNIERI (L ) CUSS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО РИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

Штамм культивируемых клеток растений Cnidium monnieri (L.) Cuss. ВСКК (ВР) N 40, используемый для получения препарата, обладающего рибонуклеазной активностью.