Способ выделения никотинамидадениндинуклеотид-глутаматдегидрогеназы из хлореллы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/06 C12N1/12 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ХЛОРЕЛЛЫ

1

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам ферментов из-растительного сырья, и может быть использовано для научных целей и в ферментной промышленности.

Известен способ выделения йикотишмидаденкндинуклеотидглутаматдегндрогеназы(НАД(Ф)-ГДГ) из термофильного штамма хлореллы - Cftlorella 0yrenoidosa 82Т путем разрушения клеток в фосфатном буфере на Q дезинтеграторе, ультрацентрифугирования с отбрасьтанием. осадка, удаления балластных веществ обработкой надосадочной жидкости стрептомицинсульфатом с поспедующим концентрированием ферментсодержащего раствора высаливанием сульфатом аммония до 52-60% степени насыщения и обессоливанием на Сефадексе, ионообменной хроматографии на дизтиламиноэтилцеллюлоэе с злюцией фосфатным буфером рН 7,0-7,4 с последующей гель-фильтрацией го полученного элюата на Сефадексе G--200, сорбцией на геле фосфата кальция и высаливания сульфатом аммония. Через 1,5-2 недели с момента разрутиения клеток в результате высаливания выпадает мелкодисперсный осадок, где сосредоточена вся активность НАД (Ф) - ГДГ t и J 2}.

Однако известный способ является длительным и при его осуществлении получают небольшой выход фермента (29%), обладающего недостаточной активностью (230-250 Ед) и чистотой (степень очистки 740).

Цель изобретения - ускорение процесса, цовышение выхода и качества целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения НАД(Ф)-ГДГ из хлореллы путем разрушения клеток в фосфатном буфере, выделения бесклеточного экстракта, осаждения из него балластных веществ и удаления осадка центрифугированием с последующим концентрированием супернатзнта осаждением сернокислым аммонием до 5б-52% степени насыщения и обессоливанием на Сефадексе, хроматографии ферментсодержащей фракщш на полисахаридном сорбенте с. злюцией фосфатным буфером рН 7,0-7,4, содержащим NaCI, и фракционирования ее на геле фосфата кальция, осаждение балластных веществ провопят нагреванием бесклеточного экстракта в 3958 течение 5-10 мин при 60-65°С, в полученный супернатант добавляют MnClj до конечной концентрации его в супернатанте 0,015-0,030 М с последующим элюированием фермента с образовавшегося осадка буфером, причем фракционирование на геле фосфата кальция проводят после обработки, сульфатом аммония и обессоливания с последующей двукратной хроматографией элюата с использованием в качестве полисахаридного сорбента аминогексил-Сефарозь и злюцией фермента линейным градиентом NaCl в пределах 0-0,10 М. В предлагаемом способе по сравнению с прототипом сокращается время выделения фермента с 20 до дней, увеличивается выход целевого продукта, а также повышается активность выделенного фермента в 2 раза. Пример. 250 г влажной клетовдой пасты термофильного хлореллы суспен днруют в равном объеме 0,07 М фосфатного буфера рН 7,4, .содержащего мМ меркаптоэтанол. Разрушение суспензии клеток осуществляют в гомогенизаторе Л-17 типа планетарная мельница 12. После разрущения клеток гомогенат разбавп ют исходным буфером и центрифугируют сначала при 6000 хд, а затем при 30000 хд в течение 30 мин. В результате полутают 770 мл бесклеточного экстракта, который прогревают 5 мин при 60-65° С и осадок денатурированных белков удаляют центрифугированием. К охлажденной до 15° С надесадрЧйой жигасост при интенсивном перемещивании добазляют по каплям 1 М МпСЬ (из расчета 3 мл 1 М МпСЬ на 100 мл бесклеточного экстракта). В этих условиях в течение 30 мин образуется

Исходный экстракт

Нагревание 5 мин при 60 - 65°С

Обработка MnCIi

Фракционирование на геле фосфата кальция

« Хроматография на

АГ-Сефарозе 4 В

Рехроматография на АГ-Сефарозе 4 В

100

0,46

86

2,8

73

58,7

44 39

820

382

956 440

1097

37 510 осадок фосфата марганца и происходит адсорбция на нем НАД(Ф)-ГДГ. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием при 8000 хд в течение мин. Элюцию фермента с осадка осуществляют 0,20 М фосфатным буфером рН 7,4 два раза порциями по 160 мл. Объединенный элюат концентрируют высаливанием сернокислым аммонием до 52% насыщения с последующим обессоливанием на колонке с Сефадексом G-25. К 60 мл сконцентрированной и обессоленной фракции добавляют гель фосфата кальция (из расчета 2 мг геля на 1 мг белка). Осадок отделяют центрифугированием, а фермент элюируют с геля 0,20 М фосфатным буфером рН 7,4. Активную фракцию концентрируют высаливанием сернокислым аммонием до 52% насьццения с последующим обессоливанием на. колонке с Сефадексом G-25. Обессоленную фракцию помещают на колонку с АГ-Сефарозой 4 В,уравновешенную старто-; вым 0,005 М фосфатным буфером рН 7,0. Элюцию фермента с колонки осуществляют линейнъпи градиентом NaCI 0-0,10 М в стартовом буфере. Активный элюат концентрируют путем ультрафильтрации , через мембрану Амикон ХМ-50 и подвергают рёхроматографии на колонке с АГ-Сефарозой 4 В. В результате получают гомогенный препарат с удельной активностью 510 Е/мг белка. Результаты очистки (НАД(Ф)-глутаматдегидрогеназы Chlorella pyrenoidosa 82 Т представлены в таблице. Технико-экономическая эффективность предлагаемого изобретения состоит в ускорении процесса, улучшейЛи качества и повышении выхода получаемого продукта. 595850 Формула изобретения Способ выделения никотинамидадениндинуклеотид- глутаматдегвдрогеназы из хлореллы путем разрушения клеток в фосфатном буфере, 5 выделения бесклеточного зкстра|ста, осаждения нз него балластных веществ и удаления осадка центрифугированием с последующим концентрированием супериатанта осаждением сернокиспкол аммонием до 50-52% степени насыщения ю и обессоливанием на Сефадексе, хроматотрафии ферментсодержащей фракции на полисахаридном сорбенте с элюцией фосфатным буфером рН.7,0-7,4, содержащим NaCl, и фрмсционирования ее на геле фосфата кальция, о т- is личающийся тем, что, с целью ускорения процесса, повыщения выхода и качества целевого продукта, осаждение балластных веществ проводят нагреванием бесклеточного экстракта в течение 5-10 мин при 60-65 С, jO в полученный супернатант добавляют MnClj 26 до конечной концентрации его в супернатанте 0,015-0,030 М, злюироваш1ем фермента с образовавшегося осадка буфером, причем фракционирование на геле фосфата кальция провоДят после обработки сульфатом аммония и обессоливання с последующей двукратной хроматографией элюага с использованием в качестве сорбента аминогексил-Сефарозы и элюцией ф ермента линейным градиентом Nad в пределах 0-0,1 М в буфере, Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе 1. Лосева Л. П., Шатилов В. Р., СофьинА.В., Кретович В. Л. Молекулщ ный вес и субъедидачная природа конститутивной НАД(Ф)-глутаматдегищ)огеназы хлореллы. ДАН СССР. Т. 232, 1977, И 3, с. 703-705. 2. Рашба Е. Я. и др. Дезинтеграция микроорганизмов. Материалы Всесоюзной конференции. Пущино-на-Оке, 1972, с. 159.