Способ определения активности протеиназ Советский патент 1986 года по МПК C12Q1/00 C12N9/76 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам измерения активности протеиназ.

Цель изобретения упрощение процесса определения активности протеиназ и повышение точности анализа. I

Сущность способа заключается в

том, что в качестве искусственного субстрата протеиназ вместо 1(амино ацил)аминонафталш-1а используют 1-(аминоацил)аминонафтапин-Б-сульфо- кислоты. После воздействия протаиназ на этот субстрат образуется 1-амино нафталин-5-сульфокислота, которую вводят в реакцию азосочетания с ди- азосоединением. Образующийся при этом окрашенный продукт растворим в воде, что позволяет определять его количество спектрофотометрически в водных растворах.

Применение способа позволяет достичь coKpautein-ui времени анализа (за счет меньшего времени инкубации и исключения операций экстракции и центрифугирования), увеличения точности анализа, так как исключаются операции переноса вещества (проба - экстракт; экстракт - центрифуга.; центрифуга - кювета спектрофотометра) , во которых часть его неизбежно теряется, упрощения анализа (за счет меньшего числа операций). Кроме того, использование и качестве диазосоед1П1е1И1я 4-нитрофени.п- диазония позволяет получать линейную зависимость между поглощением красителя и количеством получившего- . ся в ходе ферментативной реакции 4-ампнонафта и1н-5-сульфокислоты,.

П р

Определение активи м е р

ности тр1-и1сина с использованием 1- (N -карбобензоксиаргинил)аминонаф- тааин-5-сульфокислоты.

Готовят следующие рабочие растворы:

О 0,1 М трис-llCl буфер, рН 8,0;

2)2 - 1 1-(карбобензоксиарги НИЛ )ами1юнафтал1П -5-сульфо кислоты

в растворе 1;

3)1 мМ борфторида Н1ггрофенил- диазония в 0,9 М уксусной кислоте.

К 1 мл термостатировап1 ого при раствора 2 добавля от 50 мкл раствора исследуемого препарата фермента в растворе 1, переметивают встряхиванием, инкубируют 20 мин, добавляют 1 мл раствора 3 и через 5 мин определяют оптическую плот

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ность при 520 нм, используя; в качестве раствора сравнения инкубировавшуюся, как указано выше, смесь 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3, в которую фермент добавлен после приготовления сйеси. Активность фермента определяют по калибровочной кривой зависимости оптической плотности при 520 нм (максимум поглощения продукта) от содержания фермента, построенной по измерениям, выполненным в ана- логичных условиях по стандартному образцу фермента.

П р и м е р 2. Определение проводят, как описано в примере 1, используя в качестве субстрата трипсина 1-(тозилглицил-Т-пропил- -аргинил) амшюнафталин-5-сульфокислоту. Бремя инкубации 10 мин.

П р и м е р 3. Определение проводят с тем же субстратом, что и в примере 2, используя в качестве фермента тромбин. Время инкубации 2 мин, температура 37®С.

Приме р 4, Проводят .определение активности папаина, растворенного в 0,05 М трис-НС буфере, рН 8,, О, содержащем 1 этилендиамин- тетраацетата и 1 мМ дитиотрептола, используя в качестве субстрата 1- ( -карбобензоксиаргинил)амриюнафта- л тн-5-сульфокислоту. Время инкубации 10 мин, температура 25°С.

П р и м е р 5. Проводят определение активности проназы, растворенной в 0,05 Ы трис-HCl буфере рН 7,8, используя в качестве субстрата (лей- цш1)аминонафталин-5-сульфокислоту. Время инкубации 10 t-wn, температура .

П р и м е р 6. Проводят определение активности, как описано в примере 1, но в качестве фермента исиоль- зуют тромбин. Время инкубации 30 мин, температура 37°С. Результаты измерения активности указанных ферментов предлагаемым снособом соответствуют данным, полученным известными спосо- б ами,

Таким образом, использование изобретения позволяет упростить способ определения активности протеиназ и увеличить его точность за счет исключения стадий, вносящих ошибку в анализ. Кроме того, при осуществлении способа не применяются органические растворители.

Формула изобретения

1. Способ определения активности протеиназ, заключающийся в расщеплении протеиназами субстратов-производ- ных 1-(аминоацил)аминонафталина, обработке полученного продукта гидролиза диазосоединениями и измерении поглощения образующегося в реакции

азосочетания продукта, .отличаю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения точности анализа, в качестве субстратов-производных 1-(аминоацил)-аминонафтали- на используют 1-(аминоацил)аминонаф- талин-5-сульфокислоты общей формулы .

5

10

R-NH

&°)

ЗОзН

где R - аминоацил, ациламиноацнл

или пентидил.

2. Способ поп, 1, отличающий с я тем, что в качестве диазо- соединения используют соль 4-нитро- фенилдиазония.

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к способам измерения активности протеиназ. Цель изобретения - упрощение процесса определения активности протеиназ и повышение точности анализа. В качестве искусственного субстрата протеиназ вместо 1-(аминоацш1)аминонафталина используют 1-(аминоацил)аминонафта- лин-5-сульфокислоты. После воздействия протеиназ на этот субстрат образуется 1-аминонафталин-5-сульфокис- лота, которую вводят в реакцию азо- сочетания с диазосоединением. Образующийся при этом окрашенный продукт растворим в воде, что позволяет определять,его количество спектро- фотометрически в водных растворах. В качестве субстратов используют трипсин, какелен, тромбин. В этом случае время инкубации 3U мин, температура 2/°С, 1 з.п. ф-лы. Q iS (Я