Бромгидраты 6-(N @ -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-сульфамидов в качестве субстратов для флуоресцентного анализа пептидаз Советский патент 1993 года по МПК C07C311/38 

добавляют раствор 2,68 г (0,013 моль) ди- циклогексилкарбодиимида в 6 мл сухого пиридина. Реакционную смесь выдерживают при -20°С 30 мин, при +4°С - t ч и.при +20°С - 20 ч. Отфильтровывают мочевину, отгоняют пиридин при., пониженном давлении, остаток растворяют в смеси хло- роформ-пропанол 3:1. Этот раствор промывают 15 мл воды, 15 мл насыщенного .водного р-ра №С1, содержащего 1 мл конц . HCI, 15 мл 2%-ного водного аммиака и 15 мл воды. Органический слой отделяют, высушивают над безводным Na2S04, растворители отгоняют и остаток растирают с сухим толуолом. Продукт отфильтровывают, промывают сухим толуолом, сухим диэтило- вым эфиром и перекристаллизовывают из пропанола. Получают 5,64 г (выход 84%) целевого продукта с т. пл. 104-112°С, alo- 12,8° (с 1; СНзОН); ,72 (бутанол-уксус- ная кислота-вода 4:1:2)(БУВ 412),

Найдено, %: С 51,63; Н 5,85; N 12,76; Вг 11,88; 54,58

С2аНз7МбВг50

Вычислено, %; С 51.77; Н 5,74; N 12.94; Вг 12,30, 54,94.

CasHsrNeBrSO.

ЛМР-спектр (д. м.д., ДМСО): 0,94 (СНз). 3,20 (СН2).

Аналогично получают остальные соединения. Их физико-химические свойства приведены в табл.1.

Для доказательства преимущества новых субстратов определены относительные интенсивности флуоресценции и спектр поглощения детектируемых групп.

П р и м е р 2, а) Определение относительной интенсивности флуоресценции 6- аминона.фталин-1 -диэтил сульфамида (Детектируемая группа соединения (12) формулы 1),

Растворяют 0,004945 г 6-эминонафта- лин-1-диэтилсульфамида в 10 мл 95%-ного этилового спирта, 0,23 мл этого раствора разбавляют 10 мл фосфатного буфера с ,0 (0,067 М) и снимают спектр флуоресценции на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония) в относительном режиме регистрации при чувствительности 3 в кювете с толщиной слоя 1 см. Длина волны возбуждения Авозб.357 нм, ширина щели возбуждения 10 нм, эмиссии -4 нм. Концентрация измеряемого раствора ,0705- 10 моль/л, оптическая плотность при длине волны возбуждения 0,080. Полоса эмиссии имеет максимум при Д фл.477 им, высота полосы (J)92 мм. Относительную интенсивность флуоресценции рассчитывают по формуле

Is

с 10а

А.

где А - соотношение максимальной и использованной чувствительности прибора. Для 6-аминонафталин-1-диэтилсульфамида получают;

Is

92 100

4,0705 10

,. р105 -3

.

Аналогично измерены спектры флуоресценции остальных 6-аминозамещенных, а

также известных 5-аминозамещенных наф- талинсульфамидов.

б) Спектры поглощения 6-аминонафта- лин-1-сульфамидов в фосфатном буфере изг мерены на спектрофотометре Specord

М-40 (ГДР). Е - молекулярный коэффициент поглощения, моль , л см ).

Данные относительной интенсивности флуоресценции и спектры поглощения приведены в табл.2.

Из табл.2 видно, что относительные интенсивности флуоресценции детектируемых групп новых субстратов составляют (410-860), в то же время у аналогов они колеблются в интервале (9-26).

Использование новых соединений в качестве субстратов для флуоресцентного анализа пептидаз иллюстрируется примером 3. ПримерЗ. Гидролиз бромгидрата

-(N -бензилоксикарбонил)-аргинилам 1но- нафталин-1-диэтилсульфамида (12) тромбином.

К 1,8 мл 1 мкМ раствора бромгидрата 6-(№z -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-1-диэтилсульфамида в 0,02 М трис-HCI буфере, рН 7,4 0,15 М NaCI, помещенного в кювету флуориметра и термостатированного при 25°С, добавляет 200 мкл 1 мкМ раствора бычьего тромбина в том же

буфере. Наблюдают рост флуоресценции, фиксируя время, в течение которого в растворе образуется 0,1 мкМ концентрация 6- аминонафталин-1-диэтилсульфамида, т.е. в,ремя 10%-ного гидролиза субстрата (12),

которое равное 165 мин.

Аналогично проводят гидролиз других субстратов. Для этого используют следующие пептидазы: 1) Тромбин (Lundblad, R.L. etal Methods Enzymol,, 1976, v. 45, p. 156), 2)

плазмин (Kabi Vitorum, Stockholm, Sweden)6 3) фактор Xa (Kr/chnaswamy, S. et al. J. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 3291), 4) АПС (активированный протеин С) (Kfscel; W, et al. Methods Enzymol,, 1981, v. 80. p. 320), 5)

Физико-химические свойства бромгидратов 6-(гг -€ензилоксикарбонил)аргинил- аминонаФтэлин-1 -сульфамидовxN- 4. NHArotN - ZVНВг

. S02NR,R2

Использование: в качестве субстратов для флуоресцентного анализа пептидаз. Сущность изобретения: бромгидраты 6- (Na -бензилоксикарбонил)аргиниламино- нафталин-1-сульфамиде в формулы: 1-RiR2NS02 (нафталинумНАгд М01 -Z) НВг, где , R2 линейный или разветвленный (Ct-C) алкил, CsHn, циклогексил, бен- зил, или , С2И5, или NRiR2 гексаметилен, пиперидин, морфолин, Z- бензилоксикарбонил. Реагент 1: бромгидрат 6-(N а-бензилоксикарбонил)аргинил. Реагент -2: соответствующий аминонафталин сульфамид. Условия реакции: в среде сухого пиридина и толуола. 3 табл.

1и т Bv s 126-132

Н

С3Н794 118-124

10

11

12

13

Нi-CjlI, 92 116-124

&

& I

К i-CfcUj95118-126

11t-C4Hj.43141-143

НС5Н(/91118-125

Иi 89 133-141 СНг-/О 96 156-164

Н

СН,

aii

78 113-121

CjH5Cjl s 84 104-112 NR|R2

О

о

о

93 117-123 91107-113 36 119-125

,-, о т, г ч-яя«152 655ЗЭ.i2i5°.4iH-UiJ31,30(Шг)

12,8 0,71 См11,7И6Вг505i gj5,64Т2770 4,8512,102.99ССН,)

,3,8 0,73 ,|2J1| l $L11,321.4MCH,,

- „50.885,4412,52 ,95(СНг)

-12,3 ,0,6v HjBrSOjjj gj jfj jg ,2jM3,50(0)2)

Бутан

зола 4:1:2

Т а 6 л и ц а 3

Время (мин) 10%-ного гидролиза соединений формулы I различными протеазами

ejgj-NHArgCN-ZVHBr S02NR R2