ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОНАФТАЛИНСУЛЬФАМИДОВ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОГО ПРОТЕИНА С (АПС) Российский патент 1994 года по МПК C07K5/10 C07C311/38 C12Q1/37 

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно: к новым пептидильным производным аминонафталин- сульфамидов, конкретно к трибромгидрату 6-(глицил-глицил-L-аргинил-L-аргинил)-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида (I) и его бензилоксикарбонил (Z)-производному (II) общей формулы:
R= Gly-Gly-L-Arg-LArgNH где R- = 3HBr ˙(I) или C₆Н₅-СН₂-О-СО- (II) в качестве субстратов для определения активного протеина С (АПС), которые могут быть использованы также в медицине для диагностических целей.

Известны нитроанилиды три- или тетрапептидов, которые используют для анализа АПС. Конкретно такими субстратами являются: р-Gly-Pro-Arg-(2-метокси)-р-нитроанилид (S-2366), Bzl-Phe-Val-Arg-p-нитроанилид (S-2160), Bzl-Ile-Gly-Gly-Arg-p-нитроанилид (S-2222), D-Phe-L-Pip-L-Arg-р-нитроанилид (S-2238), D-Vai-Leu-Arg-p-нитроанилид (S-2266).

Однако известные соединения не являются селективными субстратами по отношению к ферменту АПС, что ограничивает или усложняет их применение. Например, этот недостаток усложняет методику измерения концентрации АПС после активирования протеина С (ПС) тромбином (ПС АПС). Перед измерением требуются отбор пробы и дезактивирование тромбина с использованием антитромбина III и гепарина, являющихся труднодоступными реагентами. Чаще всего используемый для указанной цели хромогенный субстрат S-2238 является хорошим субстратом для тромбина, т. е. он сравнительно быстро гидролизуется тромбином (см. табл. 3).

Целью изобретения является изыскание в ряду замещенных пептидов новых более селективных субстратов для фермента АПС.

Цель достигается новыми соединениями формулы I и II. Селективность обеспечивается быстрым гидролизом этих субстратов ферментом АПС и медленным - тромбином. Кроме того, свойства предложенных соединений позволяют использовать их в качестве субстрата для исследо- вания процесса активирования протеина С (ПС), что важно в медицине при анализе крови для диагностических целей.

Изобретение иллюстрируется примерами. Для установления селективности измерено время 10% -ного гидролиза, определены каталитическая константа (К_cat), константа Михаеля-Ментена (К_м) и их соотношение (К_саt/К_м). Как известно, чем выше К_cat/К_м, тем более высокая селективность субстрата. Представлено использование предложенных субстратов при определении скорости активации протеина С тромбином.

П р и м е р 1. 6-Фталимидонафталин-1-циклогексилсульфамид.

Растворяют 12,6 мл (0,11 моль) циклогексиламина и 14 мл (0,1 моль) триэтиламина в 500 мл ацетона и порциями в течение 10 мин добавляют 37,1 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-1-сульфонилхлорида. Реакционную смесь перемешивают при 20^оС в течение 4 ч. Ацетон отгоняют, остаток заливают 1 л воды, отсасывают продукт, промывают водой, сушат и перекристал- лизовывают из метанола. Получают 40,6 г (выход 93% ) продукта с т. пл. 205-209^оС.

Получено, % : С 66,36; Н 5,25; N 6,63; S 7,28
С₂₄Н₂₂N₂SO₄
Вычислено, % : С 66,34; Н 5,1; N 6,45; S 7,38.

П р и м е р 2. 6-Аминонафталин-1-циклогексилсульфамид.

Заливают 43,5 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-1-циклогексилсульфамида 500 мл метанола, прикапывают 5 мл (0,1 моль) гидразингидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол отгоняют, остаток экстрагируют 2х200 мл кипящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 17,0 г (выход 56% ) продукта с т. пл. 137-140^оС; R_f= 0,69. ПМР (ДМСО): 1,21 (СН₂), 2,86 (СН).

Найдено, % : С 63,15; Н 6,64; N 9,13; S 10,53
С₁₆Н₂₀N₂SO₂
Вычислено, % : С 63,13; Н 6,62; N 9,2; S 10,59
П р и м е р 3. Бромгидрат 6-(N^α-бензилоксикарбонил)-L-аргиниламинонафтал- ин-1-циклогексилсульфамида.

Растворяют 3,89 г (0,01 моль) бромгидрата N^α-бензилоксикарбонил-L-аргинила и 3,04 г (0,01 моль) 6-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида в 15 мл сухого пиридина, добавляют 30 мл сухого толуола и последний отгоняют. Реакционную смесь охлаждают до -20^оС и добавляют раствор 2,68 г (0,013 моль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в 6 мл сухого пиридина. Реакционную смесь выдерживают при -20^оС в течение 0,5 ч, при 4^оС в течение 1 ч и при 20^оС в течение 20 ч. Отсасывают выпавшую мочевину, упаривают пиридин и остаток растворяют в 40 м смеси хлороформ-пропанол (3: 1). Раствор промывают 15 мл воды, 15 мл насыщенного водного NaCl, содержащего 1 мл конц. НСl, 15 мл 2% -ного водного аммиака и 15 мл воды, высушивают над безводным Na₂SO₄. Растворители отгоняют, остаток растирают с эфиром, отсасывают, высушивают и перекристаллизовывают из пропанола. Получают 6,01 г (выход 89% ) продукта с т. пл. 133-141^оС. R_f= 0,73 (бутанол: уксусная кислота: вода 4: 1: 2) (БУВ 412), /α/_D²⁰ - 12,6^о (с1; СН₃ОН). ПМР (ДМСО): 1,20 (СН₂), 2,90 (СН).

Найдено, % : C 53,42; Н 5,99; N 12,50; S 4,23; Br 11,39
C₃₀H₃₉N₆BrSO₅
Вычислено, % : С 53,33; Н 5,82; N 12,44; S 4,74; Br 11,83
П р и м е р 4. Бромгидрат 6-L-аргиниламинонафталин-1-циклогексилсульфамида.

6,76 г (0,01 моль) бромгидрата 6-(N^α-бензилоксикарбонил)-L-аргиниламинонаф- талин-1-циклогексилсульфамиды растворяют в 10 мл 3N HBr в ледяной уксусной кислоте и выдерживают при 20^оС в течение 1,5 ч. Реакционную смесь выливают в 100 мл сухого эфира, выпавший осадок отсасывают, промывают эфиром, сушат. Сухой осадок растворяют в 10 мл воды, добавляют 50 мл бутанола и при встряхивании порциями по 15 мл 5% -ный водный NaHCO₃ до рН ≈7,5 водного слоя. Органический слой промывают 2х10 мл воды, бутанол упаривают, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром, сушат. Получают 4,82 г (выход 89% ) продукта с т. пл. 149-156^оС, /α/_D²⁰ - 2,0^о (с1; ДМСО), R_f= 0,43 (БУВ 412), ПМР (ДМСО): 1,22 (СН₂), 2,85 (СН).

Найдено, % : С 48,71; Н 6,25; N 15,44; S 5,32; Br 15,16
C₂₂H₃₃N₆SBrO₃
Вычислено, % : C 48,80; H 6,14; N 15,52; S 5,92; Br 14,76
П р и м е р 5. 6-(Бензилоксикарбонилглицил-глицил-L-аргинил-L-аргинил)амино- нафталин-1-циклогексилсульфамид (II).

Растворяют 1,15 г (2,5 ммоль) Z-Gly-Gly-Arg-OH˙HCl, 0,35 г (2,5 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 0,51 г (2,5 ммоль) ДЦК в 18 мл охлажденного до -20^оС сухого диметилформамида. Реакционную смесь выдерживают при -20^оС в течение 0,5 ч, при 1^оС 1 ч и заливают охлажденной до +4^оС раствор 1,36 г (2,5 ммоль) бромгидрата 6-L-аргиниламинонафталин-1-циклогексилсульфамида в 10 мл диметилформамида. Перемешивают при 20^оС в течение 20 ч, отсасывают выпавшую мочевину, фильтрат выливают в 125 мл воды и образовавшуюся суспензию экстрагируют 5х15 мл смеси этилацетат-бутанол (1: 1). Органический слой промывают 3х12 мл 5% -ного водного NaHCO₃ 10% -ного водного KHSO₄ и воды, растворители упаривают, остаток растирают с эфиром, отсасывают, сушат. Получают 1,46 (выход 68% ) хроматогра- фически чистого целевого продукта с т. пл. 189-197^оС, /α/_D²⁰ - 12,2 (с1; ДМСО); R_f= 0,45 (БУВ 412), ПМР (ДМСО): 1,20 (СН₂), 3,6 (СН), 4,98 (СН₂, Z), 7,30 (С₆Н₆, Z).

П р и м е р 6. Тригидробромид 6-(глицил-глицил-L-аргинил-L-аргинил)аминонафтал- ин-1-циклогексилсульфамида (I).

Растворяют 0,8 г (1 ммоль) 6-(бензилоксикарбонилглицил-глицил-L-аргинил-L-арг- инил)аминонафталин-1-циклогексилсульфа- мида в 5 мл 3N HBr в ледяной уксусной кислоте и выдерживают при 20^оС в течение 2 ч. Реакционную смесь выливают в 50 мл сухого эфира, выпавший осадок отсасывают, промывают эфиром, сушат. Получают 0,79 г (выход 79% ) хроматографически чистого целевого продукта с т. пл. 202-216^оС, /α/_D²⁰+4,2 (c1; ДМСО), R_f= 0,36 (БУВ 412), ПМР (ДМСО): 1,15(СН₂), 2,9 (СН).

Для установления времени гидролиза целевых продуктов используют флуоресцентный метод, поэтому определяют интенсивность флуоресценции детектируемой группы, а затем определяют время 10% -ного гидролиза субстрата. Получение результатов иллюстрируется примерами 7 и 8.

П р и м е р 7. Определение интенсивности флуоресценции 6-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида.

Раствор 6-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида в ДМСО, концентрация которого составляет 1 мМ, разбавляют 0,02 и трис-НСl буфером, рН 7,4 содержащим 0,15 М NaCl, до концентрации 1 мкМ и помещают в кювету флуориметра. Записывают высоту полосы флуоресценции в максимуме ( λ_фл.= 470 нм), λ_возб.= 352 нм на спектрофлуориметре "Hitachi MPF-4" (Япония). Высоту пика флуоресценции 6-аминонафталин-I-циклогексилсульфамида принимают за 1.

П р и м е р 8. Гидролиз тригидробромида 6-(глицил-глицил-L-аргинил-L-аргинил)ами- нонафталин-1-циклогексилсульфамида (I) ферментом АПС.

В кювету флуориметра помещают 1,8 мл 1 мкМ раствора тригидробромида 6-(глицил-глицил-L-аргинил-L-аргинил)аминонафтал-ин-1-циклогексилсульфамида в 0,02 М трис-НСl буфере с 0,15 М NaCl, рН 7,4, добавляют 0,2 мл 1 мМ раствора АПС в том же буфере и измеряют рост интенсивности флуоресценции при λ= 470 нм ( λ_возб.= 352 нм) в течении времени, фиксируя время, необходимое для 10% -ного гидролиза. Степень гидролиза определяют по флуоресценции образующегося 6-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида. Оно составляет 1,3 мин.

Аналогично проводят гидролиз субстрата II ферментом АПС. Время 10% -ного гидролиза составляет 2,0 мин.

Селективность предложенных субстратов подтверждают гидролизом по примеру 8 другими ферментами. Используют следующие пептидазы: тромбин, плазмин фактор Ха ТАП (тканевой активатор), укориназа. Времена гидролиза приведены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что времена гидролиза предложенных субстратов различными ферментами резко отличаются.

П р и м е р 9. Определение константы Михаэля-Ментена (К_м) и каталитической константы (К_сat) соединений I, II в реакции с АПС.

Приготовляют растворы соединения 1 различной концентрации (S) в 0,02 М трис-НСl буфере, рН= 7,4, 0,15 М NaCl, термостатируют при 25^оС в кювете спектро- флуориметра, прибавляют раствор АПС в том же буфере (концентрация АПС составляет 10 нМ) и измеряют рост интенсивности флуоресценции при λ= 470 нм в течение времени ( λ_возб.= 352 нм). Из этих данных определяют скорость реакции V. Данные приведены в табл. 2.

Из полученных данных строят график в координатах ; (фиг. 1). Пересечение полученной прямой с осью абсцисс дает значение , а ординат - значение .

Как видно из графика = 0,0103 мкм^-1, а = 0,0143 нМ^-1c.

Отсюда: К_м= 97 мкМ, V_мах= 70 нМ^-1 с.

По формуле K_cat= , где Е - концентрация АПС в растворе ровна 10 нМ получают величину каталитической константы
K_cat= = 7 c^-1.

Аналогично рассчитывают константы К_м и К_cat для соединения II в реакции с АПС и соединений I и II в реакции с тромбином. Рассчитанные константы в сравнении с прототипом приведены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, соотношение констант в случае реакции предложенных соединений I и II c тромбином практически очень низкое. В реакции с АПС оно возрастает в 90-18 раз. В то же время соотношение К_cat./К_м в случае прототипа показывает большую его селективность в отношении тромбина (соотношение констант по сравнению с предложенными соединениями резко возрастает).

Применение соединений I и II для исследования процесса активирования протеина С тромбином.

М е т о д и к а 1. Измерение скорости гидролиза соединения II ферментом АПС. Измеряют скорость гидролиза (V) 10 мкМ раствора соединения II ферментом АПС в различных концентрациях (С_АПС) в условиях по примеру 9. Данные приведены в табл. 4.

Из полученных данных строят калибровочный график в координатах V, С_АПС(фиг. 2).

М е т о д и к а 2. Определение скорости активации протеина С (ПС) тромбином.

В кювету флуориметра, содержащую 2 мл 10 мкМ раствора соединения II в трис-НСl буфере добавляют раствор ПС в концентрации 0,2 мкМ и 0,1 мл 1 мкМ раствора тромбина и измеряют рост флуоресценции в течении времени. Полученная кривая возрастания флуоресценции (обусловленного возрастанием скорости гидролиза с образованием 6-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида при 25^оС, λ_возб. = 352 нм, λ_фл.= 470 нм) приведена на фиг. 3. По углу наклона касательных в точках, соответствующих определенным промежуткам времени от начала процесса активирования, рассчитывают скорость гидролиза соединения II (V). При концентрации ПС= 0,2 мкМ и t= 3 мин получают V= 0,91 нМ/с. Из калибровочного графика, приведенного на фиг. 2, определяют, что такая скорость соответствует С_АПС= 2,0 нМ. Таким же образом определяют и другие концентрации образовавшегося АПС в течении времени.

Аналогично определяют скорость продуцирования АПС и при других концентрациях ПС, соблюдая неизменными концент- рациям тромбина и соединения II. Данные измерений приведены в табл. 5.

Из данных табл. 5 рассчитывают среднюю скорость образования АПС (V_ср.), т. е. скорость активации ПС, по формуле:
V_cp.=
Например, при концентрации ПС 0,2 мМ получают:
V_cp.= = 0,63 .

Использование соединения I для определения скорости активирования протеина С тромбином осуществляют аналогично по методикам 1 и 2. Данные приведены в табл. 6.

Видно, что при использовании предложенных субстратов для исследования процесса продуцирования АПС не требуется отбора проб и дезактивирования тромбина труднодоступными реагентами.

Таким образом, предложенные соединения обеспечивают повышение селективности субстрата в отношении АПС, так как время 10% -ного гидролиза ферментом АПС в 830-180 раз короче, чем тромбином, величина соотношения К_cat/K_м в случае АПС в 90-18 раз выше, чем в случае тромбина. Кроме того, указанные свойства (быстрый гидролиз ферментом АПС и медленный тромбином) обеспечивают упрощение методики определения скорости продуцирования АПС путем активирования протеина С тромбином по сравнению с прототипом, значение К_cat/К_м для которого в реакции с тромбином на ≈10³ раза более высокое, чем для предложенных субстратов в реакции с тромбином.

Производные аминонафталинсульфамидов формулы
RGly-Gly-L-Arg-LArgNH
где R = C₆H₅ - CH₂ - OCO -;
X - отсутствует;
R - H;
X = 3HBr,
в качестве субстратов для определения активного протеина С(АПС).

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к новым трибромгидрату 6-(глицил-глицил- L -аргинил- L-аргинил)аминонафталин- 1 -циклогексилсульфамида и 6-(бензилоксикарбонилглицил-глицил- L -аргинил- L -аргинил)аминонафталин- 1 -циклогексилсульфамиду. Целью изобретения является увеличение селективности. Сущность ее состоит в том, что новые субстраты быстро гидролизуются ферментом АПС, а медленно тромбином. Время их 10% -ного гидролиза ферментом АПС в 830 - 180 раз короче, чем тромбином. Для доказательства положительного эффекта расчитывают константы Михаэля-Ментена K_м и каталитическую K_cat , а по величине соотношения этих констант определяют ~ 10³ - разовое превосходство предложенных соединений по сравнению с прототипом. Указанные свойства позволяют использовать их в качестве субстратов для определения скорости продуцирования АПС путем активирования протеина С тромбином. 6 табл. , 3 ил.

Производные аминонафталинсульфамидов формулы
RGly-Gly-L-Arg-LArgNH
где R = C₆H₅ - CH₂ - OCO -;
X - отсутствует;
R - H;
X = 3HBr,
в качестве субстратов для определения активного протеина С(АПС).