Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиология и касается, отбора биологически активных соединений (БАС) с антимикробной направленностью.

Целью изобретения является повышение точности снособа.

Способ осу1 1;ествляется следующим образом.

Определяют минимальную токсическую дозу (МТД) БАС, культивируя эпителиальные клетки в среде, содержащей разные дозы БАС. Доза, которая при выбранной экспозиции вызывает изменения в 50% клеток, считается минимальной токсической.

Определяют минимальную ингибирую- щую концентрацию (МИК) биологически активных соединений, культивируя тест-микробы в среде., содержащей разные дозы БАС, Та доза БАС, которая полностью подавляет рост бактерий, считается минимальной ингибирую щей.

Определяют степень подавления адгезии путем совместной инкубации эпителиальных клеток и тест-микроба в среде, содерлсащей дозы БАС ниже или равной МИК, но в 2 и более раз ниже МТД.

Пример 1. Определение антиинфекционной активности и катапола на тест-системе стрептококка группы А и тест-культуры эпителия НЕр-2.

Испытуемый БАС - катионный поли. о

мерный антисептик катапол. Тест-микроб - стрептококк группы А, тип М2, К- 59. Среда для культивирования стрептококка - мясо-пептонный бульон Среда для культивирования ткани - 5%-ньш | гемогидролизат или среда 199 Тест-культура эпителия - 48-часовой монослой НЕр-2.

Определение МТД катапола.

Суспензию эпителиальных клеток НЕр-2 в концентрации 100-200 тыс/мл гзносят в пробирки с покровными стеклами ( мм) в объеме 2 мл на стекло. Монослой эпителия формируется в течение 48 ч при 37 С, после чего культуральную среду сливают и стекла с монослоем инкубируют в среде, содержащей катапол в дозах 1 - 100 мкг/мл (табл.1). Для сравнения монослой и1П :убируют в среде без катапола. Через 30 мин или 24 ч экспозиции среду сливают, монослой фиксируют этанолом и окрашивают азур-эо- зином. Препараты исследу19Т под микроскопом, оценивая состояние клеток (целостность монослоя, отсутствие или наличие дегенеративных изменений

в клетках) по сравнению с контролем.

Из данных табл.1 следует, что

30-минутная экспозиция монослоя с ка- таполом в дозе 50-100 мкг/мл приводит к появлению первых признаков

цитотоксического эффекта (число кле-. ток с явлениями дегенерации в 2 ра- за больше, чем в контроле). При длительной экспозиции (24 ч) основная масса клеток (75%), инкубированных с катаполом в дозе 30 мкг/мл, де- генерирована, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте. Большие дозы катапола приводят к гибели всех клеток и разрушению монослоя.

Таким образом, МТД катапола при короткой экспозиции - больше 100 мкг/мл, а при длительной экспозиции - 15 мкг/мл.

Определение МИК катапола.

В питательную среду, содержащую катапЪл в дозах 1,25-25 мкг/мл, вносят одинаковую посевную дозу стрептококка (1-10 КФЕ). Через 24 ч инкубации при отмечают выраженность

роста по помутнению среды в каждой пробирке по сравнению с контрольной (среда без катапола). Степень помутнения среды в процессе роста может быть определена количественно на

спектрофотометре при длине волны проходящего света 650 нм. Для количественного определения числа жизнеспособных клеток из пробирок с заметным помутнением среды готовят

серию десятикратных разведений, высеваемых на чашки с плотной питательной средой. По .числу колоний, формирующихся на чашках через 24 ч инкубации при 37 С, судят о концентрации бактерий в опытной и контрольной пробах. В данном опыте МЖ катапола для стрептококка группы А - 25 мкг/мл.

Определение степени подавления

адгезии катаполом.

В пробирки с монослоем эпителия НЕр-2 вносят 2 мл среды, содержащей катапол в дозах 5-100 мкг/мл и 0,2 мл суспензии стрептококка стандартной густоты (0,1 при длине волны 650 нм). Смесь инкубируют 30 мин при 37 С, клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой физиологического

раствора, фиксируют, окрашивают азур-эозином и исследуют под микроскопом, определяя степень инфици- рованности монослоя сравнительно с контролем (среда без БАС). При этом подсчитывают число инфицированных клеток эпителия (ИКЭ), среднее число кокков на одной эпителиальной клетке (х) и индекс инфицирования монослоя (ИИ), умножая ИКЭ на х, и выражают его в % по отношению к контролю, принимаемому за 100%.

Адгезивные свойства стрептококка группы А, преинкубированного с разными дозами катапола, приведены в табл. 2..

Из таблицы 2 видно, что в двух независимых постановках эксперимента удается получить хороший эффект ингибирования адгезии дозой Ю - 100 мкг/мл. В 2 раза меньшая доза (5 мкг/мл) неэффективна, а использование дозы более 100 мкг/мл приводит к проявлению цитотоксического эффекта и разрушению монослоя.

Адгезивные свойства различных видов бактерий к культуре клеток различного происхождения приведены в табл.3.

Из табл.3 видно, что различные клетки проявляют неодинаковую чувствительность к инфекции исследованными возбудителями, выделенными из клинического материала.

Влияние БАС на адгезию разных видов возбудителей к нормальньм клеткам человека (вагинальньй эпителий) приведено в табл.4.

Как видно из табл.4, антиинфекционная активность БАС выражена по- разному в зависимости от возбудител

Поскольку МТК хлоргексидина для вагинальных клеток равна 100 мкг/мл то титрование антиинфекционной активности начинают с дозы 50 мкг/мл (МТК:2). Эффективные дозы, подавляющие инфекционность псевдомонад, находятся в интервале 5-50 мкг/мл, а выбор дозы определяется тяжестью инфекции.

359300

Катапол активен при стафилококковой и псевдомонадной инфекции, причем по отношению к стафилококковой он эффективен в -интервале 5 - 50 мкг/мл, в то время как по отношению к псевдомонадной - только в дозе 50 мгк/мл.

Катамин - наиболее токсичньш для клеток препарат, что позволяет- erd использовать в концентрации не более 25 мкг/мл.

Таким образом, использование способа позволяет повысить точность определения антиинфекционной активности препаратов за счет приближения способа к условиям макроорганизма, учесть также бактериостатический эффект и влияние препаратов на ад- гезионность возбудителя. Способ не требует использования экспериментальных животных.

25 Формула изобретения

Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения путем инкубирования различных доз исследуемого биологически активного соединения с тест- культурой микроорганизмов и определения минимальной ингибирующей концентрации его по отношению к тест- микроорганизму, о тличающи й- с я тем, что, с целью повьш1ения точности способа, дополнительно определяют минимальную токсическую дозу исследуемого соединения по отношению к культуре эпителиальных клеток, а затем определяют степень адгезии тест-микроорганизма путем добавления различных- доз исследуемого соединения в систему культура эпителиальных клеток - тест-микроорганизм, при этом используют исходную дозу соединения, не превышающую 50% минимальной токсической дозы, и антиинфекционную активность соединения определяют по степени подавления адгезии тест-микроорганизма.

0

5

0

5

0

Испытуемая доза, мкг/мл

Состояние клеток после инкубации, ч

IIIEIIZIIIE:

0,5

3% клеток с дегенерацией4% клеток с нарушением формы

Не отличается от контроля 29% клеток с явлениями дегенерации

100

30%

То же

Показатели адгезии ИКЭ,% I X I ИРЬ

ZIEII

150 182

281 2450 2050 1970 6030 485 1500 2000 нт нт

Д а б л и ц а 1

9% клеток с 1% клеток с дегенерацией дегенерацией

Выраженная ва- 75% клеток куолизация с дегенера- клеток цией

То же

Гибель моно- слоя

Таблица 2

Показатели а I X I

ZIEII

Таблица 3

Кандида

421

f

Культура клеток почки Культура клеток почки века.

Культура клеток почки ны.

«ft

Эпителий вагины.

Продолжение табл.З

нт

61

76

752

Таблиц а А

Изобретение относится к области микробиологии и касается отбора биологически активных соединений (ВАС) с антимикробной направленностью. Цель изобретения - повышение точности способа за счет приближения способа к условиям макроорганизма. Сущность способа сводится к тому, что определяют МТД - минимальную токсическую дозу ВАС, культивируя эпителиальные клетки в среде, содержащей разные дозы ВАС; параллельно определяют минимальную ингибирующую концентрацию БАС, культивируя тест- микроорганизм в среде, содержащей разные дозы БАС, затем определяют степень подавления адгезии путем совместной инкубации зпителиальиых клеток и тест-микроорганизма в среде, содержащей дозы БАС, в 2 и более раз меньшие МТД. 4 табл. (Л Од СП со со