СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ НА КУЛЬТУРАХ ФИБРОБЛАСТОВ КОЖИ И ЛЕГКИХ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и биологии, преимущественно к медицинской токсикологии и касается определения повреждающего действия химических соединений на метаболизм клеток соединительной ткани человека в культуре. Данный способ может быть использован при испытании химических агентов, например, лекарственных и косметических препаратов, а также при токсикологической оценке загрязнений окружающей среды.

Совершенствование альтернативных методов с использованием культур различных тканей млекопитающих является в настоящее время важнейшей проблемой в токсикологических исследованиях. Известен способ количественного определения in vitro воздействия на мембранную стабильность животных клеток внешних факторов, влияющих на устойчивость клеток к механическому воздействию (центрифугированию) и осмотическому шоку (G 01 33/483 Болгария, а. с. N 44669). Выявление токсического действия ксенобиотиков возможно по определению активности мембраносвязанных ферментов. Например глюкозо-6-фосфазы на модели микросом печени животных (G 01 33/68, Россия, а. с. N 174835).

Известен также способ, взятый нами за прототип, определения токсичности водной среды, основанный на сравнении в контрольных и опытных образцах общего количества соединительнотканых клеток животных, находящихся в культуре в стационарной фазе роста /1/.

Однако известный способ недостаточно эффективен, поскольку он не позволяет выявлять ранние изменения метаболизма, а регистрирует конечный этап гибель клеток в культуре; не выявляет разную степень неблагоприятного воздействия ксенобиотиков из матеболизм клеток-мишеней; не предполагает выявления и изучения препаратов защитного действия на фоне токсичных ксенобиотиков.

Целью изобретения является обнаружение ранних этапов токсического действия химических агентов.

Поставленная цель достигается тем, что в отличие от известного способа определения токсического влияния водной среды на количество жизнеспособных клеток предлагается комплексная оценка изменения нескольких ключевых показателей метаболизма фибробластов, подвергнутых воздействию химических агентов. При этом выбранные для исследования показатели: 1) активность мембраносвязанной ДТ-диафоразы, фермента, принимающего участие в цитотоксическом ответе; 2)активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), фермента одного из магистральных путей метаболизма клетки; 3) устойчивость клеток к индуцированному перекисному окислению липидов (ПОЛ) определяются практически одновременно на материале каждого образца.

Сущность способа заключается в следующем. Двухсуточный монослой фибробластов кожи и легких эмбриона человека подвергали двухчасовому воздействию растворов ксенобиотиков разной концентрации в среде Хэнкса. После тщательной промывки физиологическим раствором клетки инкубировали в течение двух часов в среде Хэнкса, содержащей FeSO₄ в конечной концентрации Iм М, что вызывало индуцированное ионами переменной валентности перекисное окисление липидов. В среде инкубации спектрофотометрически определяли конечные продукты ПОЛ по реакции ТБК. В предварительных опытах нами установлено, что концентрация ТБК-положительных продуктов в среде инкубации монослоя прямо пропорциональна их содержанию в клеточном гомогенате и, следовательно, может использоваться как показатель интенсивности ПОЛ в культуре клеток. Далее в монослое спектрофотометрически определяли активность мембраносвязанной ДТ-диафоразы. В среду инкубации добавляли акцептор электронов -2,4-дихлориндофенол и субстрат NADH (оба в конечной концентрации 0,1 мМ). Показателем активности фермента служило падение оптической плотности за единицу времени, измеряемой при 600 нм. После этого этапа фибробласты еще раз тщательно промывали физиологическим раствором, клеточный монослой снимали с помощью 1%-ного неионного детергента тритона X-100, клетки разрушали гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе. После центрифугирования надосадочная жидкость служила материалом для спектрофотометрического определения ЛДГ. В качестве субстратов в реакции использовали пировиноградную кислоту в концентрации 0,4 М и 0,13 мМ NADH. За показатель активности фермента принимали уменьшение концентрации восстановленного NAD, регистрируемое как падение оптической плотности при 366 нм в течение 5 мин. Введение в инкубационную среду части образцов белков сыворотки крови альбумина или глобулина в концентрации 20 мкг/мл, сопоставимой с концентрацией белков в сыворотке крови в организме, а также 50 мкМ α токоферола позволило оценивать действие токсических ксенобиотиков в условиях, приближенных к таковым в микроорганизме, а также выявлять защитный эффект на клетки у ряда соединений.

Все количественные результаты обрабатывали статически с помощью пакета прикладных программ Stat Graphies на персональном компьютере IBM PC 286.

Пример N 1. Токсикологическая оценка влияния катионного антисептика катамина на культуру фибробластов кожи эмбриона человека по результатам трех биохимических тестов. В табл. 1 приведены сравнительные данные о влиянии катамина в концентрациях от 5•10^-1% до 5•10^-5% на ПОЛ, активность ферментов ЛДГ и ДТ-диафоразу в культуре фибробластов. Из приведенных результатов следует отметить, что катемин в концентрации 5•10^-1% вызывал быструю гибель клеток, сопровождающуюся полным отсутствием активности ферментов и продуктов ПОЛ. Дополнительный тест - окрашивание клеток, подвергшихся действию катамина, витальным красителем трипановым синим также выявило гибель всего монослоя. О быстроте гибели может свидетельствовать тот факт, что морфологические проявления деструктивных изменений практически отсутствовали, и фибробласты по строению мало отличались от контрольных, фиксированных 96^o этанолом для гистологического анализа. Инкубация монослоя с 5•10^-3%-ным катамином сопровождалась резким усилением реакции ПОЛ и значительным подавлением активности обоих ферментов. Морфологический анализ клеток, окрашенных трипановым синим показал, что к концу двухчасовой экспозиции большинство клеток также погибало. При этом строение фибробластов после обработки их антисептиком значительно отличалось от контрольных: цитоплазма клеток в опыте была сильно вакуолизирована, а ядро более конденсированным, с укрупненными резко базофильными глыбками гетерохроматина. При сопоставлении биохимических и морфологических показателей действие катамина в концентрации 5•10^-3% может быть охарактеризовано как сильное токсическое, сопровождающееся резким усилением ПОЛ, подавлением активности ферментов, конечным результатом которого явилась гибель клеток монослоя. Двухчасовая экспозиция фибробластов с катамином в разведении 5•10^-5% не вызывала усиления реакций ПОЛ и подавления ДТ-диафоразы, цитологических изменений в строении клеток, однако уровень активности ЛДГ оставался достоверно ниже контрольного, что может быть определено как слабо токсическое действие препарата на клетки.

Приведенные данные показывают динамику использованных критериев метаболического состояния фибробластов в зависимости от степени неблагоприятного воздействия химических агентов и могут быть использованы для токсикологической оценки ответа разной интенсивности в культуре клеток человека. Сходные результаты влияния на метаболизм фибробластов отмечены в исследованиях токсического действия катионных антисептиков катапола и полисепта, катионного белка протамин-сульфата, анионного антисептика додецилсульфата натрия, а также препарата клеточного сока березы. Действующие концентрации зависели от молекулярной массы и полимерности агентов.

Пример N 2. Оценка протективного действия белков сыворотки крови и a - токоферола в отношении токсического ответа фибробластов на действие катионного антисептика полисепта. Результаты исследования действия полисепта на фоне a токоферола, а также альбумина или иммуноглобулинов приведены в табл. 2 и 3. Введение в инкубационную среду a токоферола как антиоксиданта или сывороточных белков позволило в некоторой степени приблизить эксперимент к условиям макроорганизма. Наличие a -токоферола в среде предотвращало развитие в фибробластах, подвергшихся действию полисепта в концентрациях от 1 до 10^-4% процессов индукционного ПОЛ, однако не защищало ферментативные системы. Это выразилось в подавлении активности ЛДГ и ДТ-диафоразы аналогично тому, что отмечено при действии чистого антисептика. Иное защитное действие проявили альбумин и иммуноглобулины: сывороточные белки полностью подавляли токсический эффект на клетки полисепта, начиная с концентрации 10^-2% что выразилось в интенсивности реакции ПОЛ и активности ферментов на уровне контрольных измерений.

Проведенное исследование влияния ксенобиотиков различной природы на фибробласты кожи и легких эмбриона человека позволило выявить общие закономерности в ответе клеток на токсическое воздействие. Таким образом, предложенный метод комплексной оценки метаболического состояния фибробластов человека может быть использован для: 1) выявления токсического влияния различных фармакологических агентов с учетом разной интенсивности повреждающего действия; 2) определения минимальной токсической дозы антисептиков; 3) изучения действия лекарственных препаратов в присутствии естественных факторов защиты; 4)исследования механизмов действия протективных антиоксидантных препаратов; 5) выявления токсического действия ксенобиотиков для экологической оценки окружающей среды.

Использование: медицина, биология, медицинская токсикология, для определения степени поврежденного действия химических агентов на метаболизы при испытании химических соединений, например, лекарственных и косметических препаратов, а также для токсикологической очистки загрязнений окружающей среды. Сущность изобретения: предлагается комплексная оценка изменения нормального метаболизма фибробластов, подвергнутых воздействию химических агентов. При этом три показателя: 1) активность ДТ-диафоразы, 2) активность лактатдегидрогеназы, 3) устойчивость клеток к индуцированному и перекисному окислению липидов - определяются одновременно на материале каждого образца. Целью изобретения является раннее обнаружение токсического действия.

Способ выявления токсичности химических агентов на культурах фибробластов кожи и легких эмбриона человека, отличающийся тем, что, с целью обнаружения ранних этапов токсического действия химических агентов на одних и тех же клетках, оцениваются активность лактатдегидрогеназы, как индикатора нарушений целостности клеточных мембран, активность ДТ-диафоразы, как фермента детоксикационной защиты, а также уровень индуцированного перекисного окисления в качестве показателя устойчивости к стрессу на клеточном уровне.