Способ определения активности глутатионтрансферазы Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/48 

сл С

Использование: биохимия, исследование метаболизма пестицидов и лекарствен- чых веществ, уровня загрязненности водной среды ксенобиотиками. Сущность изобретения: прямое фотометрическое определение продукта ферментативной реакции глутатиона или инициатора реакции - натриевой соли 7-гидрокси-З Н-феноксазин- 3-0Н- 10-оксида (резазурин-Na). Реакционная смесь содержит фосфатный буфер, глутатион и ферментный препарат. Реакция инициируется добавкой резазурина-Na. Сразу измеряют увеличение поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или уменьшение поглощения инициатора реакции при 598 нм. Предел чувствительности метода 4,7 М. Метод позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции. 1 ил.

Изобретение относится к биохимии, точнее к способам определения активности ферментов, в частности к определению активности глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18), которое используется для исследования метаболизма пестицидов и лекарственных веществ, уровня загрязненности водной среды ксенобиотиками.

Известен способ тетраметрического определения активности глутатионтрансферазы в реакции восстановленного глутатиона с алкилгалогенидами. Способ состоит в титровании 5 мМ NaOH образующейся в результате реакции галогенооодородной кислоты.

К недостаткам метода следует отнести то, что он требует непрерывного поддержания рН 7,2 без применения буферного раствора, что снижает точность и

воспроизводимость метода. Кроме того, метод требует значительного расхода времени (около 1 ч).

Известны колориметрические методы определения активности глутатионтрансферазы, которые можно подразделить на опре- деление содержания нитрит-ионов, появляющихся в реакционной смеси в результате реакции; определение цианид- ионов; определение п-нитрофенола.

Активность глутатионтрансферазы определяется в реакциях глутатиона с нитро- алканами (нитропропан, тринитроглицерин и т.д.). Способ состоит в инкубации фермента с реакционной смесью, содержащей восстановленный глутатион, буферный раствор и субстрат с последующим отбором аликвот, добавлением сульфаниламидного реагента, затем дигидрохлорида М-(1-нафтил)этиленVJ

СЛ Ю 00

2

диамина и, после 20 мин инкубации, измерении на фотоэлектроколориметре (ФЭК) с фильтром на 540 нм.

Недостатком метода является то, что он не позволяет вести кинетические наблюде- ния за ходом реакции, требует отдельного процесса проявления, длителен (около 1 ч). Активность глутатионтрансферазы измеряется в реакциях глутатиона с органическими тиоцианатами. Способ состоит в проведении ферментативной реакции в смеси, содержащей фосфатный буфер, глу- татион. органический тиоцианат и фермент, последующей остановке реакции добавлением N-этилмалеимида, затем хлорамина Т и новой инкубации смеси. Затем добавляют пиразолоновый реагент и измеряют оптическое поглощение при 618 нм после 20 мин инкубации.

К недостаткам метода следует отнести невозможность кинетических наблюдений за ходом реакции, снижение точности определения из-за летучести образующегося цианида, существенное исключение результатов определения трудноустранимыми примесями неорганических тиоцианатов, а также его длительность (около 50 мин).

Активность глутатионтрансферазы определяют в реакции тиолиза п-нитрофени- лацетата глутатионом. Способ состоит в прямом колориметрическом определении образующегося в результате реакции п-нит- рофенола. Реакционная смесь содержит бу- ферный раствор, восстановленный гяутатион и п-нитрофенилацетат.

Недостатками метода являются подверженность субстрата неспецифическому каталитическому разложению при высоких концентрациях белка в пробе, повышенные требования к чистоте реагентов, в том числе буферных солей. Коэффициент экстинкции п-нитрофенола 8790 М при длине волны 400 нм. Граница чувствительности около 0,1 мкмоль.

Наиболее широко применяемым (базовым) и близким по чувствительности и быстроте определения к предлагаемому способу является способ спектрофотометрического определения активности глутатионтрансферазы в реакции восстановленного глутатиона с 2,4-динитрохяорбензолом 1 по схеме: .

OjN- Cl+CSH -OjN-O-SCtHCl ,

N07N0t

Способ состоит а прямом епектрофото- метрическом определении концентрации продукта реакции 3-{2,4-динитрофенил)-глу0 5

0 5

0 5

татиона. В определении используются следующие реагенты. 0,5 М фосфатный буфер, рН 6.5; 10 мМ раствор восстановленного глутатиона в дистиллированной воде, 50 мМ раствор 2,4-динитрохлорбензола в этаноле.

На 3 мл спектрофотометрическую кювету необходимо 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона, 0,06 мл раствора 2,4-динитрохлорбензола в, этаноле и разбавленный ферментный препарат. Таким образом, конечные концентрации реагентов в пробе составляют 0,1 М фосфатный буфер, 1 мМ глутатион, 1 мМ 2,4-динитрох- лорбензол. Измерение оптической плотности ведут при длине волны 340 нм в течение 1-3 мин после инициации реакции добавкой 2,4-динитрохлорбензола.

К недостаткам этого метода, являющегося прототипом изобретения, следует отнести то, что для измерений используется кварцевая оптика, так как исследуемая полоса оптического поглощения находится на границе области поглощения обычного стекла: измерения могут вестись только на одной длине волны (на одном пике поглощения), что не позволяет контролировать устойчивость продукта реакции при работе с полиферментными системами или с неочищенными экстрактами тканей. Кроме того, в качестве растворителя для субстрата используется этанол, в связи с чем он всегда присутствует в реакционной смеси, Молярный коэффициент экстинкции продукта реакции 9600 . Граница чувствительности 0,02 мкмоль.

Целью изобретения является создание высокочувствительного и быстрого способа определения активности глутатионтрансферазы, не требующего сложной оптической аппаратуры и большого количества участвующих в определении реактивов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения активности глутатионтрансферазы, заключающемся в прямом фотометрическом определении продукта ферментативной реакции глутатиона и второго субстрата, в качестве второго субстрата используется согласно изобретению натриевая соль 7-гидрокси-ЗН-феноксазин- 0 З-ОН-10-оксида (резазурина), далее именуе- мая резазурин-Na. Резазурин-Na в присутствии восстановленного глутатиона подвергается N-деоксигенированию, катализируемому глутатионтрансферазой

0

5

+ 2GSH -

GSSC + H2o

Мао

Способ состоит в приготовлении реакционной смеси,содержащей 0,1 М фосфатный буфер, 1 мМ глутатион и ферментный препарат. Реакция инициируется добавкой М раствора резазурин-Ма, Сразу вслед за этим измеряется увеличение поглощения при длине волны 573 нм или уменьшение оптического поглощения при длине волны 598 нм. В данной области длин волн возможно применение стеклянной оптики и на- иболее простого фотометрического прибора - фотоэлектроколориметра (ФЭК). Способ позволяет вести кинетические наблюдения за ходом реакции.

Используемые реагенты: фосфатный бу- фер, 0,5 М, рН 7,5; 10 мМ раствор восстановленного глутатиона в дистиллированной воде; М раствор резазурин-Na в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5; ферментный препарат.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в большей чувствительности, чем у прототипа, из-за более высокого молярного коэффициента экстинкции продукта реакции {Ј573 30000) и самого субстрата (Ј598 57150) по данным наших измерений, против 9600 у прототипа. Обнаруживается изменение концентрации на 10 М субстрата (резазурин-Na) и на М продукта; возможности использования стеклянной оптики; возможности измерения на двух длинах волн (двух пиках поглощения), что позволяет ввести в эксперимент контроль устойчивости продукта реакции при работе с полиферментными системами или с неочи- щенными экстрактами тканей, что расширяет границы его применения; возможности использования воды в качестве растворителя второго субстрата глутатионтрансфера- зы.

Отличительной особенностью данного изобретения является использование резазурин-Ма в качестве субстрата для определения активности глутатионтрансферазы фотометрическим методом. Измерения про- водят при длине волны 573 нм или 598 нм с использованием стеклянной оптики. Измерения возможны в интервале рН от 6,0 до 9,0, но предпочтительной областью является 7,5.

Способ применения предлагаемого изобретения заключается в следующем. Субстрат вносится в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, восстанов- ленный глутатион и ферментный препарат, сразу после чего проводят измерения оптического поглощения при длине волны 573 нм или 598 нм в течение 3 мин с интервалом

30 с. Полученные данные используют для расчета активности глутатионтрансферазы.

Резазурин-Na производится в СССР в промышленных масштабах, дешев и легко доступен. Реакция ферментативного N-де- оксигенирования, катализируемая глутати- онтрансферазой, в литературе не описана, поэтому предлагаемый способ является принципиально новым.

На чертеже показано изменение спектра поглощения реакционной смеси в ходе реакции, дает наглядное представление о возможности измерения скорости реакции как при длине волны 573 нм, так и при длине волны 598 нм.

Пример 1. Иллюстрирует методику измерения активности глутатионтрансферазы в оптимальных условиях.

Готовят растворы следующих реагентов; K/Na фосфатный буфер, 0,5 М, рН 7.5; 10 мМ водный раствор восстановленного глутатиона; 0,035 мМ раствор резазурин-Na в 0,01 М K/Na фосфатном буфере, рН 7.5; цитозольная фракция печени крысы, 1:9, ди- ализированная против 0,01 М K/Na фосфатного буфера, рН 6,7 (ферментный препарат).

Составляют пробу общим объемом 3 мл, содержащую 1,3 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутати7 она, 0,5 мл ферментного препарата. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-Na, смесь перемешивают, после чего немедленно измеряют оптическое поглощение при 573 нм (увеличение поглощения) или 598 нм (уменьшение поглощения). Показания ФЭК снимают в течение 3 мин с интервалом 30 с.

Составляют контрольную пробу, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, 0,6 мл буфера, 0,3 мл раствора глутатиона. В пробу вносят 0,3 мл раствора резазурин-Na и проводят те же измерения, что и с опытной пробой. Разницу в показаниях между опытной и контрольной пробами (в пересчете на 1 мин) для измерений при длине волны 573 нм используют для вычисления ферментативной активности по формуле

1000

-1

-11

, МКМОЛЬ МИН МГ

где ДЕ573 - разница в поглощении при 573 нм между опытом и контролем;

Vnp - обьем пробы, мл;

Ј573 - молярный коэффициент экстинкции продукта реакции на волне 573 нм;

гпр - количество белка в пробе, мг.

В результате измерений были получены следующие данные:

В пересчете на 1 мин получают

с 0.121 -0.075 ПП1(- Es73 о 0,015;

0,015 3 1000

-зоооо з-

5 10

-А

Активность фермента печени крысы Вис- тар в опытах составила 0,50 нмоль...

Такой же результат можно получить, проводя измерения при длине волны 598 нм по уменьшению концентрации субстрата. В этом случае вычисление активности фермента проводят по формуле

. - А Е598 V™ 1000 ,-1 -1,

А --,мкмоль-мин -Mr 1,

Ј598 Юр

где АЕ598 - разница в поглощении при 598 нм между опытом и контролем;

езэв - молярный коэффициент экстинк- ции резазурин-Na при 598 нм;

Vnp - объем пробы, мл;

гпр - количество белка в Пробе, мг.

Пример 2. Показывает влияние рН среды на результаты измерения оптической плотности.

Готовят растворы резазурин-Na в концентрации 3, М в 0,1 М буферных растворах с различными значениями рН. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 598 нм.

рН 3.4 4,5 5,5 6,0 6.5 7,0 7,5 9,0 Е598 0,03 0,08 0,15 0,18 0,18 0,18 0,18 0,19

Видно, что при значениях рН 6,0 и выше оптическое поглощение резазурин-Na остается постоянным. Практические измерения скорости реакции возможны при рН выше 5,5, однако оптимальное значение рН 7,5, так как, с одной стороны, при этом наблюдается минимальная скорость спонтанной реакции глутатиона с резазурин-Na, с другой - наиболее высокая скорость ферментативной реакции.

Вычисленное значение молярного коэффициента экстинкции резазурин-Na составляет 57150.

0

Пример 3. Определение нижнего предела чувствительности предлагаемого способа определения активности глутати- онтрансферазы.

Нижний предел чувствительности определен по методу трех о.

Готовят пробу общим объемом 3 мл, содержащую 1,6 мл дистиллированной воды, 0,6 мл 0,5 М K/Na фосфатного буфера, рН 7,5, 0,5 мл ферментного препарата и 0,3 мл 3, М раствора резазурин-Na, Готовят пробу, содержащую те же компоненты, за исключением резазурин-Na, против которой ведут измерения оптической плотности при 5 длине волны 598 нм, Полученные значения; 0,185, 0,183, 0,185, 0,185, 0,184. Затем по формуле

20

ТУГ

3-0 3 №fl

5

0

5

0

5

0

определяют величину трех дисперсий в единицах оптического поглощения. Поделив это значение 3 о 2,68-10 3 на величину молярного коэффициента экстинкции (57150), получают нижний предел чувствительности метода 4, М.

Формула изобретения Способ определения активности глута- тионтрансферазы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, восстановленный глутатион и исследуемый ферментный препарат, добавление к полученной смеси инициатора реакции и измерение оптического поглощения фотометрическим методом с последующей оценкой активности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве инициатора реакции используют натриевую соль 7-гидрокси-ЗН-феноксазин-З-ОН-Ю- оксида, измерение проводят на фотозлект- роколориметре, при этом измеряют интенсивность поглощения продукта реакции при длине волны 573 нм или инициатора реакции при 598 нм, а оценку активности ведут по увеличению интенсивности поглощения продукта реакции или по уменьшению интенсивности поглощения инициатора реакции в сравнении с контролем.

А

0,5-1

0.2 0.3

. ..

500525550

0 отсчета. (чере$ 5с

через Змин

через 6 пин

, через 9мим

,.«.. через 12пин