Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 Советский патент 1988 года по МПК A61K38/21 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства интерферона.

Цель изобретения - повышение выхода интерферона.

.Для осуществления способа используют штамм Pseudomonas speciee VG-84, несущий плазмиду pVG3, депонированный

с указанными выше антибиотиками и проверяют на способность синтезировать интерферон.

Полученные культуры выращивают в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30 С на L-бульоне в течение 6-10 ч до достижения титра

бактерий 2-5x10 клеток/мл. Бактерии

в Центральном Музее промьшленных мик-io собирают центрифугированием, разру20

25

30

роорганизмов института ВНИИгенетика под номерои ЦМПМ В-3076.

Плазмида pVG3 является молекулярным гибридом между многокопийной векторной плазмидой широкого круга )5 хозяев рАУС34 и плазмидой pIFN-o(2-P2, Содержащей репликон pBR322 и ген интерферона альфа - 2 и определяющей устойчивость клеток к тетрациклину и ампициллину. В плазмиде pIFN-oC2-P2 ген интерферона альфа-2 находится под контролем регуляторных областей гена D бактериофага 0 XI74. Векторная плазмида рАУС34 размером в 9,4 тысяч пар нуклеотидов относится к Inc P-4/Q группе несовместимости, детерминирует устойчивость клеток к стрептомицину, Плазмидную ДНК рАУС34 и pIFN- 2-Р2 обрабатывают рестрикта- зой Pst I и лигированной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli С600. Трансформанты отбирают на полноценной питательной среде, содержащей антибиотики - ампициллин (50 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (25 мкг/ /мл) , В клонах-трансформа,нтах обнаружена плазмидная ДНК, названная pVG3, которая по размеру и рестрик- ционной карте соответствует гибриду между плазмидами рАУС34 и pIFN- 2-Р2. Плазмида pVG3 детерминирует устойчивость клеток к стрептомицину подобно рАУС34 и тетрациклину и ампициллину подобно pIFN- 2-P2. Размер плаз- признаки МИДЫ pVG3 - 14,8 тысяч пар нуклеотидов равен сумме размеров плазмид pIFN-L42-P2 - 5,4 тысяч пар нуклеити- дов и рАУС34 - 9,4 тысяч пар нуклеотидов .

В один из штаммов Е. coli СбОО, содержащий гибридную плазмиду pVG3, бьша введена коньюгативная плазмида широкого круга хозяев R 751. В серии коньюгативных скрещиваний плазмида pVG3 была переведена в бактерии рода Pseudomonas и другие грам-отрицатель- . ные бактерии. Бактерии-трансконью- ганты отбирают на селективной среде

шают ультразвуком и определяют содержание интерферона в клеточных экстрактах радиоиммунологическим методом. Бало проверено 18 штаммов грам-отрицательнык бактерий, относящихся к родам Eschenichia, salmonlla Pseudomonas, Methy Lomonas,. Erwinia, Rhizobicem. Большинство проверенных штаммов продуцировали активный интерферон. Неибольшей продуктивностью отличался штамм Pseudomonas Sp. VG-84 В указанных условиях этот штамм пролJ/J

дуцирует 5x10 -1x10 ME интерферона на 1 л культуральной жидкости.

Культурально-морфологические приз наки.

Морфология под микроскопом. Грам- подвижные палочки дли

35

40

50

55

отрицательные ной 3-5 мкм.

Морфология на разных средах.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при. 25-30°С образует колонии с неровным краем диаметром 3-4 мм, поверхность шероховатая, цвет свет- лоз еленый.

Мясо-пептонный бульон. Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды. Рост без аэрации слабый.

Минимальная среда М 9 с глюкозой. На 2 сут роста образует колонии диаметром 2-3 мм серого цвета, колонии круглые, шероховатые.

Физиологические и биохимические

Растет при 25-35°С, оптиму 30°G, рН 7,0. Источники углерода: утилизирует глюкозу, арабинозу. Источники азота: хорошо усваивает аммо ний, мочевину.

Пример. Штамм Pseudomonas sp. VG-84 выращивают при 28°С в течение 12 ч на скошенной агаризованно среде следующего состава: триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, аденин 80 мл/л, глюкоза 10 г/л, стреп томицин 150 мг/л, тетрациклин 50 мг/л вода дистиллированная - до 1 л, агар - агар 15 г/л (среда А). Выросшую на косяках биомассу используют

0

5

0

5 признаки

шают ультразвуком и определяют содержание интерферона в клеточных экстрактах радиоиммунологическим методом. Бало проверено 18 штаммов грам-отрицательнык бактерий, относящихся к родам Eschenichia, salmonlla Pseudomonas, Methy Lomonas,. Erwinia, Rhizobicem. Большинство проверенных штаммов продуцировали активный интерферон. Неибольшей продуктивностью отличался штамм Pseudomonas Sp. VG-84. В указанных условиях этот штамм пролJ/J

дуцирует 5x10 -1x10 ME интерферона на 1 л культуральной жидкости.

Культурально-морфологические признаки.

Морфология под микроскопом. Грам- подвижные палочки дли35

40

50

55

отрицательные ной 3-5 мкм.

Морфология на разных средах.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при. 25-30°С образует колонии с неровным краем диаметром 3-4 мм, поверхность шероховатая, цвет свет- лоз еленый.

Мясо-пептонный бульон. Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды. Рост без аэрации слабый.

Минимальная среда М 9 с глюкозой. На 2 сут роста образует колонии диаметром 2-3 мм серого цвета, колонии круглые, шероховатые.

Физиологические и биохимические

Растет при 25-35°С, оптимум 30°G, рН 7,0. Источники углерода: утилизирует глюкозу, арабинозу. Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину.

Пример. Штамм Pseudomonas sp. VG-84 выращивают при 28°С в течение 12 ч на скошенной агаризованной среде следующего состава: триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, аденин 80 мл/л, глюкоза 10 г/л, стрептомицин 150 мг/л, тетрациклин 50 мг/л, вода дистиллированная - до 1 л, агар - агар 15 г/л (среда А). Выросшую на косяках биомассу используют

для приготовления посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 10П мл среды А (без агара) и выращивают на качалке в течение 6 ч при интенсивном перемешивании (240 оборотов/мин) и температуре . Оптическая плотность посевной культуры - 2 оптических единицы.

Ферментацию проводят в ферментере оснащенном системами для регулирования температуры, рН, скорости перемешивания и аэрации, датчиком для измерения парциального давления раст воренного кислорода. Для этого посевную культуру вносят в количестве 5% в ферментер с жидкой питательной средой А (без агара) и выращивают в течение 6 ч при ,5°С, рН 6,7-6,9 при интенсивной аэрации и перемешивании. Режим аэрации и перемешивания подбирают таким, чтобы рост культуры не лимитировался концентрацией растворенного кислорода, для чего значение парциального давления кислорода поддерживают на уровне 5-10% от насыщения. Для стабилизации рН используют аммиачную воду.

Рост биомассы контролируют путем измерения оптической плотности куль- туральной жидкости, которую измеряют каждый час на ФЭК-60 при длине волны 520 нм в кювете в длиной оптического пути 0,5 см. Ферментацию прекращают при величине оптической плотности 5 оптических единиц.

После окончания ферментации концентрация интерферона составляет 1x10 ME на 1 л культуральной жидкости. Для определения концентрации интерферона используют твердофазную модификацию радиоиммунологического анализа с применением антиинтерферо- новых кроличьих поликлопальных анти

0

5 0

5

0

5

0

тел и меченых йодом - 125 мьш1иных моноклональных антител, а также определяют антивирусную активность интерферона по его защитному эффекту от цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на культурах диплоидных человеческих фибробластов. В качестве референс-препаратов используют национальные интерфероны - стандарты MRC Б 69/19 (Великобритания) и Р8 (СССР).

Клетки, собранные центрифугированием после проведения ферментации, используют в качестве источника интерферона. Клетки суспендируют в 0,1 М трис-буфере рН 7,5 из расчета 1 г клеток на 5-10 мл буфера и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток отделяют центрифугированием при 3000 g и из супер- натантной фракции (клеточного экстракта) выделяют гомогенный интерферон альфа-2 с использованием известных методов - отделения нуклеиновых кислот осаждением 0,5%-ным полиэти- ленимином, фракционирования сульфатом аммония при 65% насыщения, адсорбционной хроматографии на стеклах с контрлируемым размером пор и иммуно- аффинной хроматографией на иммобилизованных на Сефарозе 4В мьшиных антиинтерфероновых моноклональных антителах.

В результате очистки получен элект рофоретически гомогенный препарат интерферона альфа-2 с очисткой в 210 раз и выходом по активности 41%, обладающий удельной активностью 4, МЕ/мг. По удельной активности, молекулярному весу (18,4 кД), аминокислотному составу и т.д. вьще- ленный интерферон альфа-2 не отличается от природного человеческого .лейкоцитарного лнтерферона альфа-2..