Способ получения рестриктазы В @ AI Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-йнг женерных и молекулярно-генетических работах.

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы II класса) широко применяются в структурных исследованиях ДНК, конструировании рекомбинантных молекул ДНК |П: vitro, идентификации генетических аномалий у человека и разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний, во многих областях молекулярной биологии, биохимии, вирусологии и микробиологии. Обладая высокой специфичностью к узнаваемой и расщепляемой нуклеотидной последовательности ДНК, рестриктазы представляютудобную модель для изучения проблемы нуклеиновОбелкового узнавания,

Рестриктаза, выделенная из Xanthomonas manihotis 7AS1, расщепляет ДНК фага А в 24 участках, ДНК Ad2 в пяти, а трех, плазмиду pBR 322 в двух и не гидролизует ДНК обезьянего вируса SV40.

Согласно предлагаемому cnocolBy продуцент Bacillus brevls ВКМ-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода,- азота и минеральные соли в условиях азрации. целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Рестриктаза BbvAl - изошизомер XmnI, узнает и расщепляет участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ...GAANNT NNTTC...3. Фермент гидроЛизует ДНК фага А по 24 участкам, ДНК Ad2 по пяти, ДНК X 174 по трем, плазмиду pBR 322 по двум и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезьянего вируса SV40. Поиск штамма-пр| дуцента осуществляют с помощью разработанного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в толуольных экстрактах из клеток микроорганизмов с последующим электрофоретическим анализом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Штамм Bacillus brevis 677 получен из Всесоюзной Коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится :под№ ВКМ B-677H CIB 8146 АТСС 10068 (каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных Микроорганизмов) и не является идентичным описанным в литературе продуцентам рестриктаз Bbvl, Bbvll и BbvSI. Характеристика штамма. Морфологические особенности; подвижные пaлoчkи, грамтположительны (признак варьирует Грам Грам). Культурально-биохимические свойства: на скошенном агаре рост по штриху нежный, мелкие, блестящие, гладкие колонии; на чашке Петри с мяср-пептонным агаром мелкие, блестящие, гладкие колонии; на мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера осадок. Отношение к кислороду - аэроб. Утилизация углеводов: на глюкозе, манните К. Индол и сероводород не образует. Желатина уколом - Разжижение. Чувствительность к антибиотикам: культура обладает множественной устойчивостью к антибиотикам; резистентна к пенициллину, канамицину, хлорамфениколу, оксациллину; чувствительна к стрептомицину, тетрациклину, неомицину, линкомицину, гентамицину, метициклину, нистатину. Опт;1Мдльные условия выращивания и хранения культуры. Культура В.brevis ВКМ-677 хорошо растет в условиях аэрации при на бульоне Хоттингера с добавлением 2% глюкозы, а также На среде, содержащей в 1 л, г; дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; Na2HP04-12 НгО 2,2; NaCI 3; Mg S04 0,5; CaCl2 0,25, рН 7,2-7,5. Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды. Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней. Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном виде в ампулах. Культура непатогенна для мышей. Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы BbvAl обьемом 4050 мкл содержит 0,05 М трис-НС, рН 7,5, 0,01 М MgCIa, 0,001 М , дитиотреитола, 0,1 М NaCI, 2 мкг ДНК фага А и 0,5-10 мкл фермента. Инкубацию проводят при 37°С в течение 60 мин. Продукты расщепления ДНК фага Арестриктазой BbvAl определяют электрофоретически в 1,5%-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. За единицу активности фермента принимают то минимальное количество его (в мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А при 37°Сза 1 ч инкубации в стандартных условиях инкубационной смеси. Приме р 1. Культуру Bacillus brevis ВКМ-677 предварительно адаптируют в течение ночи при 37°С в условиях аэрации на основной питательной среде, содержащей в 1л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; Na2HP04-12H20 2,2; NaCi 3; MgS04 0,5; CaCh 0,25, рН среды 7,2-7,5. Инокулят для ферментации готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из.расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации. Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему при 37°С с аэрацией, рН 7,2-7,5. Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,3-7,6. Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста. Выход сырой биомассы составляет 79 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы BbvAl в биомассе оценить не возможно, поскольку культура В.brevis ВКМ-677 продуцирует еще две эндонуклеазы рестрикции BbvAll и Bbvllico специфичностью соответственно рестриктаз Clal и BspMll. Выделение .рестриктазы BbvAl. 10 г биомассы Bacillus brevis ВКМ-677 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуковой дезинтеграцией при 2-4°С. После удаления остатков клеточных Оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугирования бесклеточный экстракт обрабатывают полиэтиленимином, фракционируют сернокислым аммонием, сульфатаммониевую

фракцию диализуют и ведут последовательно хроматографию на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52. Ватман) и голубой сефарозой (фирмы Фармация) и рехроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе.

Получают 22000 ед рестриктазы в 20 мл глицеринового буфера. Выход очищенного препарата фермента 2200 ед на 1 г сырого веса биомассы. Рестриктаза BbvAl стабильно сохраняет активность в течение не менее 6-8 мес при хранении при -20°С. Фермент не содержит примес.ей t ocфaтaз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклет аз, пригоден для картирования ДНК и всех видов генно-инженерных работ.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus brevis ВКМ-677 проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют мясо-пептонный бульон с2% глюкозы.

Выхрд биомассы 6-7 г/л культуральной жидкости.

После очистки фермента выход рестриктазы составляет 1800 ед/г биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую рестриктазу BbvAl.

Поиск новой рестриктазы проведен путем скрининга у 70 штаммов бактерий рода Bacillus.

Биомасса штамма Bacillus brevis ВКМ677 содержит зндонуклеазу рестрикции BbvAl, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 GAANM NNTTC...3 в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах.

Выход очищенного фермента BbvAl составляет 1800-2200 ед на 1 г сырой биомассы.

Эндонуклеаза рестрикции BbyAl не содержит примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.

Учитывая особенности локализации участка узнавания рестриктазы Bbvl на векторных молекулах ДНК. новый фермент может быть использован в биотехнологйческих и молекулярно-генетических работах.

- .

Формулаизобре те и и я Способ получения рестриктазы BbvAl, заключающи| ся в культивировании продуцирующего микроорганизма Bacillus brevis ВКМ-677 на питательной СРФде1 содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации с последующим выделением фермента и очисткой его хроматографией.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекулярно-генетических работах. Изобретение заключается в том, что продуцент B.brevis ВКМ В-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.brevis ВКМ- 677 со^^ержит новую рестриктазу BbvAl, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5'..,G.AANN' NNTTC...3' В количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvAl составляет 1800-2200 ед активно.сти на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции ВbvAf не содержит примесей фос- фатаз, зкзонуклеаз и неспецифических зндонуклеаа. Учитывая особенности локализации участка узнавания рестриктазы BbvAl на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в биотехноло- гичеСких и молекулярно-генетических работах.(Лс