Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы В @ 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы, в молекулярной биологии и генетической инженерии.

Цель изобретения - выявление штамма Bacillus alvei, обладающего более высоким выходом рестриктазы.

Штамм - продуцент Bacillus alvei 675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза Bav i - изошизомер рестриктазы Pvu II, узнает участок нуклеотид- ной последовательности ДНК CAG 4-CTG и расщепляет ДНК бактериофага А в 15участках, ДНК аденовируса 2 в 24, ДНК SV 40 в трех, плазмиду pBR322 в одном и не гидро- лизуетДНК0Х 74.

Поиск штамма - продуцента проводили с помощью разработанного экспресс-метода тестирования активности рестриктаз в толуольных экстрактах из микробных клеток с последующим электрофорезом в агароз- ном геле продуктов расщепления ДНК.

Штамм Bacillus alvei 675 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под № ВКМ-675 - NCIB 8212 и не является идентичным штамму Bacillus alvet ATCC 6348, продуценту известной рестриктазы Bav I.

Характеристика штамма.

Морфологические свойства. Палочки размером 0,5-0,8 х 2-3 мкм расположены

О

VI

00 00

со со

поодиночке и парами, споры, Грам-положи- тельны (признак непостоянный, варьирует ), Клетки подвижны (признак варьирует).

Культурально-биохимические свойства. На скошенном агаре - слабый нежный налет. Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями. На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттин- гера - равномерное помутнение, сероватая нежная пленка. Отношение к кислороду - аэроб. Утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, сахарозе образует кислоту. Лакмусовое молоко-свертывание, пептонизация. Индол - не образует. Желатина уколом - медленное, кратерообразное разжижение. Чувствительность к антибиотикам. Культура обладает множественной рези- стентностью к антибиотикам,Резистентна к пенициллину, стрептомицину, канамицину, полимиксину, неомицину, метициклину, нистатину, ампициллину. Чувствительна к тетрациклину, левомицетину, эритромицину, олеандомицину, кярбенициллину, линкоми- цину, гентамицину, оксациллину.

Оптимальные условия выращивания и хранения (среда, рН, температура, срок пересева). Культура хорошо растет на твердых и жидких питательных полноценных средах: мясо-пептонном агаре, бульоне Хоттингера, среде LB.

На бульоне Хоттингера за 4-5 ч рост достигает Aeso - 1,2-1,4. Выход биомассы 6-8 г/л. При выращивании на среде LB накопление биомассы ниже 4-5 г/л.

Оптимальные для образования ре- стриктазы Bav 675I условия - культивирование на среде Хоттингера в течение 4-5 ч до достижения конца логарифмической фазы роста.

На среде рыбный экстракт культура растет медленно, а активность рестриктазы в биомассе значительно ниже, чем при культивировании на средах Хоттингера и LB.

Оптимальная температура роста 37°С, но растет и при 40-45°С,

Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7-10 дн. Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Культура непатогенна для мышей. Существенным фактором культивирования является аэрация, В анаэробных условиях выход рестриктазы Bav I снижается. Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы Bav 675I объемом 25-50 мкм содержит 0,01 М трис-HCI, рН 7,5, 0,01 MgCIa, 0,001 М дитиотреитола, 0,05 М NaCi, 1 мкг ДНК фага А и 1-20 мкл фермента. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Продукты расщепления ДНК рестрик- тазой определяют электрофорезом инкубационной смеем в геле агарозы с

последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. За единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А при

0 37°С за 1 ч инкубации в стандартных условиях инкубационной смеси.

Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках. Полученный фермент проявляет

5 активность в присутствии в концентрации 5-410 мМ при значении рН 7,5-8,3 и температуре 30°С. Добавление в инкубационную среду KCI (20-30 мМ) стимулирует активность фермента, в более высокой кон0 центрации (100 мМ) KCI ингибирует рестрик- тазную активность.

Пример 1. Культуру Bacillus alvel BKM В - 675 предварительно адаптируют на основной питательной среде (бульон Хоттин5 гера), содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 10 г NaCI, 1 г К2НР04 и до 1 л воды. Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и

0 размножают в условиях аэрации.

Выращивание культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С в условиях аэрации (1 л воздуха на 1 л пита5 тельной среды), рН среды 7,6, Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в интервале 7,4-7,6, Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста. Выход сырой

0 биомассы составляет 8 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы Bav I 6 х 103 ед./г биомассы.

Определение активности фермента проводят во фракциях градиента после хро5 матогрзфии на ДЭАЭ-целлюлозе (DE-52, Ватман) экстрактов из обработанных ультразвуком клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК.

0 Выделение эндонуклеазы рестрикции Bav 675 I.

10 г биомассы Bacillus alvel 675 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4°С. После

5 удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клегок фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленг- ликоль / декстран. Обогащенную рестрик- тазой верхнюю фазу хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте KCI на

колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (DE-52, Ватман), затем на колонке с голубой сефаро- зой.

Получают 2,4х104 ед. активности ре- стриктазы в 4,0 мл глицеринового буфера. Выход очищенного препарата фермента 2,4x10 ед. активности на 1 г сырого веса биомассы. Препарат рестриктазы Bav 675 I стабильно сохраняет активность в течение не менее 6-9 мес. Фермент пригоден для картирования ДНК и генно-инженерных работ.

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus alvel 675 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1 л 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCI и до 1 л воды.

Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазы в биомассе 5x10 ед./г биомассы. После проведения очистки фермента, выход рестриктазы Bav 675 I составил 2,0х103 ед./r биомассы. Таким образом, биомассы штамма Bacillus alvel 675 содержит рестриктазу Bav

I, узнающую и расщепляющую нуклеотид- ную последовательность ДНК CAG i CTG, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Содержание рестриктазы Bav I в биомассе 5 - 6х103 ед. на 1 г сырой биомассы. Для изошизомера Bav I - рестриктазы Pvu II содержание фермента ниже. Выход очищенного фермента Bav I составляет 2,0- 2,4х103 ед. активности на 1 г сырой

биомассы, выход очищенной рестриктазы Pvu II - 370 ед. на 1 г биомассы. Рестриктаза Bav I не содержит примесей неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus alvei ВКМ В- 675 - продуцент рестриктазы Bav I,

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии и генетической инженерии. Целью изобретения является выявление штамма Bacillus alvei, обладающего более высоким выходом рестриказы Bav I. Штамм - продуцент Bacillus alvei ВКМ В- 675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Bacillus alvei 675 содержит рестриктазу Bav I, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК CAG CTG в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Для изошизомера Bav I - рестриктазы Pvu II выход очищенного фермента 370 ед.на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного фермента Bav I составляет 2,0-2,4x10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 5-6 раз превышает известного Pvu II (370 ед). СО с