Способ определения @ -глутамилтранспептидазы Советский патент 1986 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к усовер- шествовакному способу определения 1 -глутамилтранспептидазы, которая используется в клинико-химических лабораториях для диагностики заболева- НИИ печени.

Цель изобретения - интенсификация процесса.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве суб- страта f--глутамилгЗ-сульфо-Сили карбокси) п-анилида.

Пример 1. Получение Y-ГЛУ- тамил-п-нитроанилид-З-карбоновой кислоты (GLU РА 3-карбоновой кислоты)

9,1 г 2- нитро 5-аминобенэойной кислоты (50 мг-моль) н 14,2 ангидрида фталоилглутаминовой кислоты (55 мг-моль) растворяют в 50 мл абсолютного диоксана с добавлением 13 мл трибутиламина. Реакционную смесь кипятят в течение 2 ч гфи обратном потоке. После охлаждения в реакционную смесь добавляют 100 мл 2 н аммиака и извлекают взбалтыванием вы- ;релившнйся трибутиламин с эфиром. Водный раствор концентрируют досуха, растворяют в метиловом спирте и с помощью гидраэингидрата устанавлийают рН tO. Реакционный раствор вьщерживают около 20 ч при комнатной температуре. При этом частично выделяется продукт, который затем фильтруют и промывают метиловым спиртом. Метанольный фильтрат концентрируют досуха и растворяют остаточное масло приблизительно в 300 мл дистиллированной водьт.

Этот водный раствор хроматоргра- фируют над колонкой с 100 мл Довекс (Dowex) 4 ормиатной формой, промьгеают 300 МП дистиллированной воды, градуируя 2 л воды 0,5 н.раствора карбоната аммон1м. Элюат собирают 100 мл фракциями и исследуют методом тонко- слойной хроматографии в системе бута нол: ледяная уксусная кислота 5 вода в соотношении 50j15:t5 (проявление хроматограмм: в ультрафиолетовом свете синие пятна или после увлажнения нинги рином и последующего нагрева - коричневые пятна зон,содержащих ами- нокиелоту)«Фракции,содержащие продук глутамнновая кислота -нитроанилид -3-карбоновая кислота (значение R 0,25),собирают и концентрируют в ваку- уме досуха .Оставшийся порошок перемешивают в абсолютном спирте,фильтруют И В вакууме над хлористым кальцие

Выход 7 г If-глутамил-п-нитро-- анилид-3-карбоновой кислоты, моно- aм юниeвaя соль (58% теоретического).

Ультрафиолетовый спектр: А 317 нм, е 11,7 см/моль/при 317 нм.

Пример 2. Применение у -глу- тамил- -нитроанилид-3-карбоновой кислоты (GLU РА-карбоновой кислоты) для определения ,-глутамилтранспеп- Ti-щазы ( 1 - GT) .

При энзиматическом расщеплении высвобождается 2-нитро-5-аминобензой- ная кислота.

Проведение измерения,

В кювету вводят пипеткой 1 М трис- -буфер, 100 мг-моль глицилглицина, рН 8,25-2,8 мл 130 мг-моль GLU РА-3- -карбоновой кислоты в указанном буфере 0,2 мл, нагревают до , определение начинают при добавлении человеческой сыворотки 0,2 мл, смешивают , оптическую плотность отсчитывают при 405 им, одновременно включают хронометр. Через 1,2 и 3 мин отсчет повторяют.

По разности оптических плотностей в минуту (аЕ/мин) берут средние значения и вводят его в расчет.

Расчет ведут следующим образом.

Международная единица U является энзимной активностью, которая при- переводит 1 ммоль субстрата в 91инуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например, сыворотки. Для расчета энзимной активности на мл (А) используют общую формулу

мин €- d V

йЕ(ми/мл)

,, 5

Коэффициент экстинкции (€)3-ка1 - бокси 4-нитроанилина составляет в условиях опыта при 405 нм 9,4 /ммоль. Толщина (d) слоя кюветы 1 см, объем используемой сыворотки (V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2мл. Измерение затухания Е осуществляется через промежутки в 1 мин. При этом

А 4Е(405 нм)/мин х 1702 (ми/мл).

Пример 3. Получение -глу- тамил-4-нитроанилид-З-сульфоновой кислоты.

115 г аннпин-т-4-нитро-3 сульфоновой кислоты и 150 г ангидрида фталоилглутаминовой кислоты суспендируют в 2 л абсолютного диметилформамнда и затем нагревают на масляной бане до . .При достижении этой температуры сус10

15

пензию выдерживают в течение 1 ч при 145°С и затем охлаждают. Осадок от-. филь ровывают и концентрируют фильтрат досуха. Маслянистый остаток растворяют в метаноле и устанавливают рН 9 80%-ной гидроокисью гидразина. Через 24 ч отсасывают образовавшиеся кристаллы и промывают небольшим количеством метилового спирта. Фильтрат сушат и при охлаждении осторожно разлагают охлажденным ацетоном. Образующийся при этом осадок отсасывают, промывают хорошо ацетоном и растворяют остаток в воде при перемешивании. Нерастворимый в воде остаток отфильтровывают и с помощью аммиака устанавливают рН раствора 7,5. Путем добавления ацетона выкристаллизовывается аммониевая соль у-глутамил- -Д-нитроанилид-3-сульфоновой кислоты.20 Продукт очень хорошо кристаллизуется в светло-желтые кристаллики. Т.пл. 186-187°С.

Максимум поглощения спектра при 290 нм 4,57 см /ммоль.

Выход около 115-120 г, причем 15-20 г можно еще получить из кристаллизационного маточного раствора.

Общий выход около 135 г соответствует 70% теоретического.

Растворимость соединения при комнатной температуре хорошая и достигает около 160% степени превращения У -глутамил-п-нитроанилида при одинаковых условиях.

Пример 4. Применение GLU РА-3-сульфоновой кислоты для определения -ся:,

При энзиматическом расщеплении

25

30

35

Международная единица U являет энзимной активностью, которая при 25 С превращается 1 ммоль субстрат в минуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например сыворотки. Для расчета энзимных активностей на мл (А) используют общую формулу

V.1000

.

Коэффициент экстинкции (б) м-ни роанилгзд-З-сульфоновой кислоты в условиях опыта при 405 нм составляе 5,45-см /моль. Толщина (d) слоя кюветы 1 см, объем введенной сыворотк (V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2. Измерение оптической плотности 6 ос ществляют через промежутки в 1 мин.

Отсюда полгучают

А дЕ(405 нм)/мин х 2936 (ми/мл)

Предлагаемый способ определения у-глутамилтранспептидазы, предусмат ривающий использование в качестве субстрата -глутамин-3-сульфо(или ,карбокси)- 1-анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют У глутамшт-ь-нитроанш1Вд позволяет значительно интенсифицировать процесс. Максимальная скорост реакции достигается при концентрации лищь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодаря его хо- рощей растворимости. Максимально достигаемая концентрация при использовании известного субстрата составляет 2,9 ммоль, в СВЯЗИ с

соединения по предлагаемому способу ограниченной его. растворивысвобозедается « -нитроанилид-3-суль- мостью. фоновая кислота.

В соответствии с изобретением при использовании карбоксильного производного достигают увеличение скорости реакции на 20%, а в случае J производного сульфокислоты в два раза больше скорость; Это значит, что продолжительность определения может быть уменьшена вдвое.

Проведение измерения.

Пипеткой вводят в кювету 0,1 трис- -буфер, 150 мг-моль шлицилглицина 45 рН 8,5 - 2,8 мл 130 мг-моль GLU РА- -3-сульфоновой кислоты в вьшеприве- денном буфере 0,2 м.п, нагревают до 25°С, определение начинают добавкой человеческой сыворотки 0,24 мл, пере-50 ешивают, оптическая плотность отсчи-- тывается при 405 ми, одновременно включают хронометр. Точно через 1, 2 и 3 мин повторяют отсчет.

По разностям оптических плотное- SS тей в 1 мин (лЕ/мин) находят среднее значение и вводят его в расчеты.

Расчет ведут следующим образом.

10

15

, 20

25

0

5

Международная единица U является энзимной активностью, которая при ; 25 С превращается 1 ммоль субстрата в минуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например сыворотки. Для расчета энзимных активностей на мл (А) используют общую формулу

V.1000

.

Коэффициент экстинкции (б) м-нит- роанилгзд-З-сульфоновой кислоты в условиях опыта при 405 нм составляет 5,45-см /моль. Толщина (d) слоя кюветы 1 см, объем введенной сыворотки (V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2. Измерение оптической плотности 6 осуществляют через промежутки в 1 мин.

Отсюда полгучают

А дЕ(405 нм)/мин х 2936 (ми/мл).

Предлагаемый способ определения у-глутамилтранспептидазы, предусматривающий использование в качестве субстрата -глутамин-3-сульфо(или ,карбокси)- 1-анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют У глутамшт-ь-нитроанш1Вд, позволяет значительно интенсифицировать процесс. Максимальная скорость реакции достигается при концентрации лищь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодаря его хо- рощей растворимости. Максимально достигаемая концентрация при использовании известного субстрата составляет 2,9 ммоль, в СВЯЗИ с

мостью.

В соответствии с изобретением при использовании карбоксильного производного достигают увеличение скорости реакции на 20%, а в случае J производного сульфокислоты в два раза больше скорость; Это значит, что продолжительность определения может быть уменьшена вдвое.

Формула изобретения

Способ определения f -глутамил- транспептидаэы путем обработки замещенного -глутамил-п-анилида гли- цилглицином при добав{сении челове- ческой сыворотки и измерения скорост образования гидролизованного продукS12)14Ч96

та, отличающийся тем.Приоритет п г) признакам:

что, с целью интенсификации процесса.О). 12.71 исходным продукт - в качестве замещенного у-глутамил--глутамил-3-карбокси-и -анилида используют t- глута -h -аинпид.

мил-3- сульфо (или карбокси ) - VI-ани-03.07.73 исходный продукт - глута- лид,мин-3-сульфо- 1 - -анилид.

Изобретение касается аналитической химии, в частности способа определения f -глутамилтранспептида- зы (ГТП), используемой для диагностики заболеваний печени. Для интенсификации процесса используют другое бо- лее растворимое замещенное f-глута- мил-п-анилида - -глутамил-3-суль- фо (или карбокси)-п-аншгад (ГА). Определение ГТП ведут обработкой ГА глицинолицином при добавлении человеческой сьгооротки. Далее определяют изменение оптической плотности (ОП) и скорость образования гидролизованно- го продукта. По разности ОП в минуту, берут средние значения и рассчитывают показатель энзимной активности. Снижается в два раза продолжительность определения, максимальная концентрация ГА составляет 6-8 ммоль против 2,9. О) (2 сл С«9 4 :л 1C с/1