Реактив для турбидиметрического определения липазы Советский патент 1988 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особенно тур- бидиметрическим методом.

Цель изобретения - повышение чувствительности реактива для определения липазы.

Способ осуществляется следующим образом,

-Сухой реактив для турбидиметричес кого определения липазы, содержащий защитный коллоид и жидкий триглице- РИД, при этом в качестве защитного коллоида содержит мономерную пенто- зу или гексозу, или полимер, содержащий 2-10 пентозных или гексозных групп, или твердьш полиэтипенгликоль в качестве жидкого триглицерида используют такой, в котором остатки жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей, дополнительно содержит азид щелочного металла, калиевую соль желчной кислоты, колипазу, мочевину, буферное вещество рН 6,0 при следующем соотношении компонентов

Жидкий триглицерид 0,47-6,58

Калиевая соль

о

13,5-34,4 0,0065-0,05

0,36-0,87

3,82-28,29

4,85-12,6

0,22-3,25

Остальное

Предпочтительнь1ми примерами пригодных полигидроксисоединений являются маннит и подобные многоатомные

спирты, олигосахарид глюкозы, манно- за, мальтогептоза, полиэтиленгликоль со средним молекулярным весом между 3500 и 7000 и др.

Защитными коллоидами являются такие аминокислоты, как апанин, а также гуммиарабик. Предпочтительным количеством защитного коллоида соответственно смеси защитных коллоидов является 50-70 мас1.%. В качестве особенно пригодной оказалась смесь сахарного спирта н полиалкиленгликоля. В качестве желчных кислот принимаются во внимание известные поверхностно-активные желчные кислоты, как

холевая кислота, таурохолевая кислота, дезоксихолевая кислота соответственно их соли щелочных металлов, в особенности натриевая соль. Предпочтительное количество составляет

10-15 мас.%.

Дальнейшей существенной составной частью предлагаемого реактива является колипаза Особенно пригодной является свободная от примесей

колипаза. Предпочтительное количество составляет 0,003-0,01 мас.%.

В качестве консервантов используют такие, которые не нарушают ферментативную активность подлежащей определению липазы. Особенно пригодными являются азиды щелочных метал

лов, в особенности азид натрия. Од

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к реактиву для определения липазы особенно турбидиметрическим методом. Цель изобретения - повьшение чувствительности реактива для определения липазы. Сухой реактив для турбидиметри- ческого определения липазы содержит защитный коллоид и жидкий триглице- рид (в котором остатки жирных кислот имеют 8-20 углеродных атомов и 1-8 углерод-углеродных двойных связей). В качестве защитного коллоида используют мономерную пентозу или гексозу, или полимер, содержащий пентозных или гексозных групп, или твердый полиэтипенгликоль. Защитный коллоид включает также сахарный спирт, полиэтиленгликоль. Жидкий триглицерид содержит также триолеин, глицерин-три-октаноин, глицерин три- 2-октаноин, глицерин-три-тетраделано- ин, глицерин-три-2,4,6,8-тетрадека- ноин, глицерин-три-эйкозаноин. В качестве защитного коллоида реактив дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота. Реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты, колипазу, буферное вещество рН 6,0-10,0 из группы ди- или три- этаноловых буферных веществ, активатор (из группы хлоридов). Реактив обладает повышенной чувствительностью и имеет более высокую воспроизводимость и стабильность результатов за счет стабилизации экстинции при фотометрическом измерении. СО 05 vl 00 О5 4j

В качестве триглицерида используют как естественные, так и синтетические триглидериды с остатками жирных кислот между 4 и 22 С-атомами. Пригодным является также трибутирин. Наиболее предпочтительны триглицериды с длинноцепочечными остатками ненасыщенных жирных кислот, в особенности триглицериды, остатки жирных кислот которых имеют 8-20 С - атомов и 1-8, преимущественно 1-3, углерод-углерод двойных связей. Благодаря легкой доступности особенно предпочтительным является триолеин, также можно использовать оливковое масло. Предпочтительное количество триглицерида составляет 0,2-2,0 мас«%.

В качестве защитного коллоида используют полигидроксисоединения, сывороточный альбумин, поливинилпирро- лидон, твердые полизтиленоксиды.

нако пригодными являются также другие консерванты, как например тиозид, и другие серосодержащие консерванты. Предпочтительное количество консерванта составляет 0,2-0,7 мас.%.

Реагент содержит еще мочевину, предпочтительно 10-15 мас.%.

В качестве буферного вещества пригодны все известные буферы, которые в состоянии в рамках предлагаемого реактива устанавливать рН между 0,6 и 10,5. Предпочтительная область рН

между 8,3 - и 9,5, Примерами пригодного буфера являются диэтанрламинный буферJ, триэтаноламинный буфер, Tris- буфер и Соо(1-буфер, как Hepes-буфер (пригоден для добавки перед лиофилизацией). Тара-буфер и Bicine. Предпочтительным является Tris-буфер. Предпочтительное количество буфера 3 и 10 мас.%. Дальнейшим активатором являются ионы кальция. Так как

они с дезоксихолевой кислотой дают нерастворимые соединения, в присутствии кальция в качестве желчной кислоты предпочтительной является тауро дезоксихолевая кислота, так как она допускает более высокие концентрации кальция в области 1-5 ммоль.

Предлагаемьй реактив содержит также активатор для липазы. Активаторы липазы являются известными. Предпоч- чительными являются хлориды, в особенности хлорид натрия, но также другие хлориды щелочных или щелочноземельных металлов, поскольку они не ведут к образованию нерастворимых соединений с другими составными частями реактива или пробы, Активирую- ще действуют также ионы магния.

Сухой реактив получают путем лио- филизации одной из составных частей эмульсии, полученной обычным методом При этом буферное вещество, мочевина и в данном случае также часть защитного коллоида и консерванта, а также активатора преимущественно добавляют к сухой эмульсии лишь посл лиофштизации. Подвергнутая лиофили- зации эмульсия может попучаться обычным методом, например путем внесения всех составнь х частей в водный растворитель, эмульгирования с помощью обычных методов, как ультразвук и т.п. ив заключение замерзания при около -40 С и сушки в вакууме при

в

t

обычных условиях ( ).

При лиофилизации должны быть добалены соль желчных кислот, колипаза, минимум 20 мас.% защитного коллоида, минимум часть консерванта и в данном случае активатор. Предпочтительный способ получения водной эмульсии, определенной для лиофилизации, состоит в том, что названные состав- ные части, исключая триглицерид, растворяют в воде и затем при перемешивании в раствор сильной струей впрыскивают раствор триглицерида в летучем органическом растворителе. В качестве летучего органического растворителя при этом пригодны в особенности алифатические спирты и кето ны с числом углеродных атомов 1-4.

Остальные составные части предла- гаемого реактива, а именно буферное вещество, мочевина и в данном случае остальной защитный коллоид, консервант и активатор, могут добавляться

к лиофилизату непосредственно после его получения или немного позднее.

о

0 5

Пример 1.0,06 г CaCl

2

0

5

22,72 г дезоксихолата натрия, 25,35 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,1 г азида натрия, 0,02 г колипазы и 50,8 г маннита растворяют в 1,0 л дистиллированной воды. В полученный раствор при перемешивании с давлением 2 бара через сопло диамет- ром 1,5 мм впрыскивают 1,42 г триоле- нина, растворенные в 32 мл н-пропано- ла. Полученную триолеиновую эмульсию

5 замораживают при -40°С и сушат путем ЛИОФШ1ИЗ ации.

8,95 г дезоксихолата натрия, 7,25 г Tris, 1,20 г Tris-HCl, 7,5 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 1,97 г NaCl, 16,2 г мочевины и 56,9 г маннита смешивают друг с другом в состоянии, 2 мае.ч. полученной буферной смеси с помощью спирального смесителя смешивают с 1 мае.ч. лиофипизата в гомогенный реактив .

Для проведения определения липазы к 150 мг этого реактива добавляют 2,5 мл воды, смешивают с О,1 мл про0 бы и фотометрически измеряют при

365 нм при 25°С по отношению к воде. В качестве пробы пригодными являются, например, сьшоротка крови, содержимое двенадцатиперстной кишки, моча и

5 другие жидкости организма,

Правильность метода проверяют путем сравнения с титраметрическим методом по Рикку. При изучении 60 серий человеческой липазы различной активности получались следующие данные: корреляция: (х Рикк, у - тест согласно изобретению) у 0,93, х-20,, г-0,96.

Линейность теста остается получающейся до примерно 1300 единиц по Рикку.

Одна единица по Рикку 1 моль FFА/мин - Iv, FFA - высвобождающиеся жирные кислоты.

П р и м е р 2, 1,500 г маннита 0,900 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 4000, 0,524 г дезоксихолата натрия, 1,5 мл кол1шазы и 8 мг азида натрия растворяют в 50 мл дистиллированной водыо В этот раствор при перемешивании через мелкое сопло впрыскивают 150 мг триолеина, растворенные в 5,0 мл пропанола. Полу20

25

ценную эмульсию замораживают при и лиофипизируют.

3,50 г мочевины, 3,73 г дезокси- холата натрия, 0,40 г NaCl, 0,10 г g азида натрия, 2 мг карбоната кальция, 2,355 г Tris и 0,200 г Tris-HCl ин-. тенсивно перемешивают друг с другом К этому добавляют измельченный сухой лиофилизат и гомогенно перемешивают ю

Комплексная смесь 8,219 г содержит; маннит 1,500 г; полиэтипенгли- коль 0,900 г сумма 2,4 г 29,2 мас.%5 дезоксихолат натрия 4,254 г 51,7 мас.%; колипаза 1,5 мг; азид натрия 9 мг; Tris-буфер 11,355 г; Tris-HCl 0,200 г сумма 1,,9 мас.%; мочевина 3,5 г 42,5 мас.%.

, 37 мг этой смеси растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды и фотометрически измеряют с 200 мл пробы (сыворотки) при 340 нм и 25 или по отношению к воде или воздуху. Из разности ослабления в минутах проводят определение активности липазы,

Пример 3. 8,41 г альбумина : сьшоротки крупного рогатого скота, 12,2 г дезоксихолата натрия, 0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы раст- 30 воряют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолеина в 7 мл пропанола. Полученнзпо эмульсию замораживают при -40 С и лиофилизируют.

17,4 г маннита, 4 г полиэтилен- гликоля твердого, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г HaCl, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Tris и 0,4 г Tris-HCl размалывают и интенсивно смешивают друг с другом. К этому добавляют измельченную сухую эмульсию и все гомогенно перемешивают.

90 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения смешивают со 100 мл пробы (сьгооротки). Реакция проводится при 340 (365) нм Н фотометрически.

1367867

эмульсию замораживают при и лиофилизируют.

17,4 г,, маннита, 4 г твердого поли- этнп енгликоля, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г NaCl, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Tris и 0,4 г Tris-HCl измельчают и интенсивно смешивают друг с другом, К это- му добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают.

90 мг этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллированной воды и после растворения сме- 15 шивают со 100 мл пробы (сьгооротки). Реакцию проводят при 340 (365) нм Нл

фотометрически.

Пример5. 4,205 г полиэтилен- гликоля с молекулярным весом 4000,

4,205 г альбумина сьшоротки крупного рогатого скота, 1,22 г дезоксихолата натрия, 0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолени- на и 7 мл пропанола. Полученную эмульсию замораживают при -40°С и лио- филизирзпот.

17,4 г маннита, 4 г полиэтиленгли- коля с молекулярным весом 4000, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г NaCl, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Tris и 0,4 Tris-HCl измельчают 3g и интенсивно смешивают друг с другом. К этому,добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают,

90 мл этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллиро- 40 ванной воды и после растворения см е- шивают со 100 мл пробы (сыворотки). Реакцию проводят фотометрически при 340 (365) нм Н.

П р и м е р 6, Рецептура дана в 45 мас.%:

Триглицерид

Защитный коллоид

Калиевая соль

желчной кислоты

Колипаза

Азид щелочного

0,47 68,00

50

13,48 0,0066

Пример4. 8,41 г аланина, 1,22 г дезоксихолата натрия,0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворя- ют в 100 мл дистиллированной воды,при перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолеина в 7 мл пропанола. Полученную

фотометрически.

Пример5. 4,205 г полиэтилен- гликоля с молекулярным весом 4000,

0

25

30

55

4,205 г альбумина сьшоротки крупного рогатого скота, 1,22 г дезоксихолата натрия, 0,02 г азида натрия и 0,034 г колипазы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. При перемешивании в этот раствор под давлением впрыскивают раствор 3,5 г триолени- на и 7 мл пропанола. Полученную эмульсию замораживают при -40°С и лио- филизирзпот.

17,4 г маннита, 4 г полиэтиленгли- коля с молекулярным весом 4000, 7 г мочевины, 7,47 г дезоксихолата натрия, 0,82 г NaCl, 0,2 г азида натрия, 2,71 г Tris и 0,4 Tris-HCl измельчают 3g и интенсивно смешивают друг с другом. К этому,добавляют измельченную сухую эмульсию и гомогенно перемешивают,

90 мл этого порошкообразного реактива добавляют в 2 мл дистиллиро- 40 ванной воды и после растворения см е- шивают со 100 мл пробы (сыворотки). Реакцию проводят фотометрически при 340 (365) нм Н.

П р и м е р 6, Рецептура дана в 45 мас.%:

Триглицерид

Защитный коллоид

Калиевая соль

желчной кислоты

Колипаза

Азид щелочного

металла

Мочевина

Буферное вещество

Активатор

0,47 68,00

50

13,48 0,0066

0,36 10,75 5,61 1,33

П р и м е р 7 Рецептура дана в мае.%;

Триглицерид 6,58 Защитный коллоид , 56,05

Калиевая соль

желчной кислоты16,34

Колипаза0,06

Азид щелочного

металла0,41

Мочевина13,16

Буферное вещество5,85

Активатор,1 ,54

Предлагаемый реактив обладает более высокой чувствительностью в сравнении с известным, а также имеет более высокую воспроизводимость и стабильность результатов за счет стабилизации экстинкции при фотометрическом измерении.

Формула изобретения

Реактив для турбидиметрического определения липазы, содержащий в качестве защитного коллоида пентозу, гексозу, сахарный спирт, полиэтилен- гликоль или их смесь и жидкий тригли- церид, отличающийся тем, что, с целью повьпаения чувствительности реактива, в качестве жидкого триглицерида реактив содержит триоле-

1

367867 ин

8

10

15

20

, глицерин-три-октаноин, глицерин три-2-октаноин, глицерин-три-тетра- деланоин, глицерин-три-2,4,6,8-тетра- де каноин, глице рии-три-эйко з аноин или глицерин-три-2,4,6,8,10,12,14,16- эйкозаноин, в качестве защитного коллоида дополнительно содержит альбумин крупного рогатого скота, и кроме того, реактив дополнительно содержит азид натрия, калиевую или натриевую соль желчной кислоты, колипазу, бу-. фериое вещество рН 6,0-10,0, выбранное из группы: ди- или три-эта- нолоных буферных веществ, активатор, выбранный из группы: хлористая доль натрия, кальция ипи магния, при следующем соотношеиии компонентов,мае.%:

Жидкий триглицерид 0,47-6,58

Калиевая соль

5

желчной кислоты

Колипаза

Мочевина

Азид щелочиого

металла

Буферное вещество

Активатор

Защитш коллоид

13,5-34,4

0,0065-0,05

3,82-28,3

0,36-0,87 4,«5-12,6 0,22-3,25

Остальное