Реактив для определения глицерина фотометрическим методом Советский патент 1990 года по МПК C12P7/20 C12N9/04 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина триглицеридов в сыворотке крови.

Целью изобретения является реактив включающий глицериноксидазу, характеризующейся более высокой специфической активностью.

Указанная цель достигается за счет использования глицериноксидазы из Aspergillus Spec. DSM 1729 (микроорганизм почвы), которая была получена с молекулярным весом 90000 и специфической активностью между 2000 и 8000 V/мг, активность которой снижается под действием SH-реагентов, и на которую не влияет присутствие серно-кислой меди и уксусно-кислого свинца.

При определении триглицеридов вначале проводится их ферментативный гидролиз под действием липазы и

(Л

эстеразы до глицерина и количество образовавшегося свободного глицерина определяют с помощью глицериноксидазы, измеряя либо расход кислорода, либо количество перекиси водорода.

Потребление кислорода определяют поляриметрически с помощью кислородного электрода, реже используется газовая хроматография.

Перекись водорода может быть определена как титрованием, так и потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим способами. Предпочтительным способом является ферментативный способ с применением пероксидазы. При применении последней в качестве хромогенного вещества (красителя) используют соединения, которые после проведения реакции с фенолом могут быть определены фотометрически, например 2,2 -аминобенэ- тиазолинсульфокислота, 4-аминоанти- пирин, фенилендиаминсульфокислота

СП

СЛ

Јь J О СЛ

О4

метилбензотиазолонгидраэон и буферный раствор. Кроме этих реагентов дополнительно реактив может содержат растворитель, стабилизатор и/или поверхностно-активные вещества.

Предпочитаемыми поверхностно-активными средствами являются Гена- полр ;алкилполигликолевый эфир, тритон. октилфенолокись полиэтилена

октилфенолокись полиэтилена (fa и Брийда , а также полиэтиленгликолевый эфир лаурилового, стеарилового и олеилового спирта.

При указанной величине рН 6,8- 8,0 фермент имеет хорошую стойкость,

Предпочтительная комбинация реагентов состоит из

100-250 KV/л (333-833 мг/л)

глицериноксидазы;

5-50 KV/л (.20-200 мг/л)

пероксидазы;

0,2-5 ммоль/л (38-955 мг/л)

индикатора (4-антипирин

аминозамещенный);

5-50 ммоль/л (64-6400 мг/л)

парахлорфенола;

1-5 г/л поверхностно-ак- тивного вещества;

рН 6,8-8,0 буферного раствора,

Пример 1. Определение глицерина по образованию перекиси водорода с Приготовляют два реактива.

Реактив 1.

0,1 ммоль/л триэтаноламина

(HCl-буфер, рН 8,0);

2 г/л холата натрия

(4,7 ммоль/л);

1150 мг/л парахлорфенола

(10 ммоль/л);

86 мг/л аминозамещенного

4-аминоантипирина (0,5 ммоль/л);

40 мг/л пероксидазы (10 V/мл).

Реактив 2. 1600 мг/л глицеринокси дазы (500 V/мл).

Для проведения определения 2 мл реактива 1 и 0,2 мл реактива 2 вводят пипеткой в кювету. Экстинкцию Е, измеряют на фотометре при 546 нм. Непосредственно после этого инициируют реакцию добавлением 20 мкл пробы. Для определения глицерина в качестве пробы могут быть применены водные среды всех типов, например пищевые экстракты, содержащиеся в организме жидкости, и сыворотка.

После проведения реакции в течение 20 мин измеряют экстинкцию Kg. Температура выдержки составляет 25°С.

0

5

5

0

5

0

5

Оценку производят по калибровоч- i ной прямой, на которой разность измеренных экстинкиий &Е Е--Е1 стандартного глицеринового раствора находится в зависимости от концентрации глицерина.

Конечная концентрация в исследуемой смеси составляет:

45 V/мл - 144 мг/л глицериноксидазы;

9 V/мл - 36 мг/л пероксидазы;

0,45 ммоль/л-86 мг/л 4-антипирина аминозамещенного;

9 ммоль/л-1156 мг/л парахлорфенола;

4,3 ммоль/л-1800 мг/л холата

натрия;

рН 8,0 0,09 моль/л триэтаноламин/

/НС1 - буферный раствор

Пример 2. Кинетическое определение .

Проба. Водный стандартный раствор (содержание глицерина от 10 до 100 мг/дл).

Реактив. 0,1 моль/л Pipes-буфера; 1,7 моль/н Н,1Ю,-, РН 7,0; 3,0 г/л холата натрия; 0,5 ммоль - 90 мг/л аминоантипирина, аминозамещенного;10,0 ммоль/л парахлорфенола (1170 мг/л)г, 10,0 V/л (40 мг/л) пероксидазы; 121,0 V/л 403 мг/л глицеринокси- даэы.

Определение проводят на Gemsaec Fast анализаторе-автомате: температура 25°С; длина волны при измерениях 546 нм; объем пробы 10 мкл;1 разбавитель () 50 мкл; объем реактива 500 мкл. Время измерения: первое показание 35 с после начала, второе показание 315 с после начала.

Были получены следующие результаты:

Пробы (водный стандартный раствор) .

Глицерин (VV-тест), Значение мг/длглицерина-00,%

1 I105

21101

32100

43101

54100

6599

7699

8799

96102

Пример 3. При кинетическом определении применяют реактив со следующим количественным соотношением компонентов: от 0,05 до 0,5 моль/л Pipes-буфера; от 0,5 до 2,0 моль/л Н3ВОЭ-, рН от 6,8 до 8,0; от 1 до 5 г/л холата натрия; 0,2- 5 ммоль/л (38-955 мг/л) 4-аминоанти- пирина, аминозамещенного от 5 до 50 ммоль/л (640-6400 мг/л парахлор- фенола, от 5 до 50 KV/л (20-200 мг/л пероксидазы, от 100 до 250 KV/л (.333-833 мг/л) глицериноксидазы.

Изобретение может быть осуществлено на автоматизированном анализаторе (спектрофотометре), имеющемся в биохимических лабораториях.

П р и м е р 4. Определение глицерина через образование гОг при применении различных аминозамещенных 4-аминоантипирина. Осуществляют аналогично примеру 1, причем реактив 1 содержит различные аминозамещенные 4-аминоантипирин (0,5 ммоль/л).

Получены следующие результаты:

Проба. Водный стандарт глицерина 45 мг/дл глицерина.

Производное Нахождение вновь, 4-аминоантипирина Фенилендиаминсульфокислота102

МВТН101

р-МВТН99

4-аминоантипирин (сравнение)101

Пример 5. Кинетическое определение глицерина при применении различных поверхностно-активных веществ .

Осуществляют аналогично примеру 2, причем реактив вместо 3 г/л холата натрия содержит такое же количество другого поверхностно-активного вещества.

Составитель

5

0

Получены следующие результаты. Проба. Водный стандарт глицерина (45 мг/дл глицерина).

Поверхностно-активное Нахождение веществовновь,%

Ацетилтриметиламмоний бромид101

Полиоксиэтилен лаурило- вый простой эфир

(Brij 35)103

20 этокг.и-сорбитанмо- нолаурат (Твин 20)98

10,5 этоксн-нонилфенол (Тергнтол NPX)99

Тезит100

Дезоксихолат натрия97,5

Изотридеканол-полиглико- левый простой эфир (Genapol X-80)101

Холат натрия (сравнение)99 Формула изобретения

25

5

5

0

Реактив для определения глицерина фотометрическим методом, содержащий глицериноксидазу из рода Asper- gillus, пероксидазу, индикатор, по- о верхностно-активное вещество, буферный раствор, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности, он содержит глицериноксидазу из Aspergillus DSM 1729, в качестве индикатора содержит 4-анти- пирин аминозамещенный и парахлорфенол, в качестве поверхностно-активного вещества холат или дезокснхолат натрия, а буферный раствор с рН 6,8-8,0 при 0 следующем соотношении компонентов, г/л:

Глицериноксидаэа из

рода Aspergillus

Пероксидаза

4-Антипирнн аминозамещенный

Парахлорфенол

Холат- или

дезоксихолат натрия

Буферный раствор

рН 6,8-8,0

Конюхова

0,333-0,833 0,02-0,20

0,038-0,955 0,640-6,400

1,0-5,0 До 1 л

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина и триглицеридов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение специфической активности. Для этого используется глицериноксидаза из ASPERGILLUS SPEC. ASM 1729.

Редактор Ю. Середа

Техред Л.Сердюкова Корректор О. Кравцова

Заказ 467Тираж 478Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5