Реактив для определения тригицеридов Советский патент 1979 года по МПК G01N31/14 

I

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к определению триглиперидов, в продуктах питания, крови и сыворотке.

Известен реактив для определения триглииеридов, содержащий липазу из KhilOPUS arPtl-ixu , буфер, ot -химотрипсин, глицеринкиназу, лактатдегидрогеназу, сывороточный альбумин аденозин-5-трифосфата, фосфоенолпировиноградную кислоту, восстановленный никотинамид - адениндинуклеотид, пируваткиназу ij.

Недостатками реактива являются большой расход фермента и длительность проведения анализа для определения триглииеридов.

По технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому реактиву наиболее близок реактив для определения триглнцеридов, содержащий липазу из Rtiizopus arriiizus , карбоксилостеразу из микроорганизмов, додецилсульфат натрия, иикотинамид - аденин - динуклеотид в восстановленной форме.

аденозинтрифосфат, фосфоенолпируват, лак татдегидрогеназу, фосфоенолкпназу, глицеринкиназу, aльбy шн сыворотки, сульфа магния, буфер и воду 2,

Недостатком этого реактива является невысокая точность определения, так как в сильно липемических сыворотках появляется муть в результате осаждения выделяющихся в свободном виде жирных кислот, что сильно препятствует оптическому определению.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Цель достигается описываемым реактивом для определения триглицеридов, который содерхшт липазу из RIllZOpus orrfilZUS , карбоксилэстеразу из микроорганизмов, додещиюульфат натрия, ник;от11намид - аденил-динуклеотид в восстановленной форме, аденозинтрифосфат, фосфоенолпирзват, лактатдегидрогеназу, фосфоенолкиназу, глицеринкиназу, альбумин сыворотки, сульфат магния, буфер и воду, а также дополнительно - сое нение обшей формухш (СН2 2°)« ; где R - алкильная или алкенильная г па - 20 П- 7-20, при следующем соотношении комп тов, вес%: Липаза из Rtl-jzopus arrilUus 0,01-1,0 Карбоксилэстераза 0,001-2 из микроорганизмов Додецилсульфат 0,001 -0,0 натрия Никотинамид-аденин-динуклеотид-вв ее стан овленн ой 0,07-1,40 Аденовинтрифосфат 0,6-6,0 Фосфоенолпируват 0,1-0,9 Лактатдегидро- 0,05-0,5 геназа Фос;фоенолкиназа О,02-О5 Глицеринкиназа О,005-О,5 Альбумин сыворотки 0,О1-0,2 Сульфат магния с содержанием ионов магния 0,03-0,3 0,1-3,0 Соединение общей формулы RO(CH,gCH2O)H где алкильная или алкенильная группа ; 0,0015-0 11-7-20 Остальное Отличительный признак предлагае реактива состоит в том, что он допо тельно содержит соединение обшей ф лы ROCCHg CHjjO) И где К - алкильная или алкенильиая па С - С2о; П - 7-20. Применение предлагаемого реакти повышаетТОЧНОСТЬ определения. Кр того, он позволяет сократить продол тельность определения до 1О мин и этом работать при комнатной темпер ре. Пример 1. Реактив согласн изобретению приготавливают из след смесей: 1) раствор буфера: 0,05 М натр фосфатный буфер, рН 7,0, содерлшши 4 ммолъ сульфата магния О,О1% доде сульфата натрия, 0,015% полигликол 44 эфира цетилстеарилового спирта (с 12 моль окиси этилена); 2)коферментная смесь 10 ммоль нкотянамид-аденил-динуклеотид в восстаовленной форме (НАДН), 22 ммоль ТФ - СНА-СОЛИ, 18 ммоль ФЭП-СНА3)ферментная смесь 40О ед.акт/мл ипазы (Ktiizopus otr-i -hizus) 50 ед. акт/мл карбоксилзстеразы {из микроорганизмов) 50 ед, акт/мл фосеенолкиназы (ФК) (из мускулов кролика), ЗОО ед. акт/мл лактатдегидрогеназы (ЛДГ) ( из серыа свиньи) в Виде суспензии в растворе сульфата аммония; 4)150 ед. акт/мл глицеринкиназы (ГК), суспендированной в растворе сульфата аммония. Смеси 1-4 могут храниться при 4 С минимально в течение одного года. Смесь 2после растворения при этой температуре может храниться около двух недель. Из реактивов 1-3 приготавливают смесь, которая в охлажденном виде может храниться около двух дней. Смесь 2 к тому же растворяют предварительно в дистиллированной воде. Для приготовления реакционной смеси смешивают растворы реактивов 1; 2 и суспензию реактива 3в объемном соотношении 5О:1,0;1,О. Определение с контрольной пробой. 5,0 мл смеси .1-3 смешивают с 0,1 мл сыворотки. Затем отбирают 2,0 - 2,5мл и смешившот их с 0,01 мл суспензии реактива 4 (проба); остальное служит контрольной пробой,Растворы пробы и контрольной пробы выдерживают около 10 мин при 20-25 С и измеряют экстинкцию пробы по отношению к величине контрольной пробы. Найденную величину применяют ДЛЯ расчета. Определение без контрольной пробы, 2,5 мл смеси 1-3 смешивают с О,О5мл сыворотки, выдерживают 10 мин при 20-25 С и измеряют экстинкцию этого раствора. Затем прибавляют О,О1 мл суспензии 4 и через 10 мин снова изме-. ряют экстиикцию. Разницу между обоими показаниями применяют для расчета. Измерения проводят на фотометре при 365, 340 или 334 нм. Расчет проводят в зависимости от длины воли измерения умно жением рааницьх экстинк.ций на 15,5 (365 нм) или 8,23 (340 нм),-или 8,53 (334 нм), При этом результат получают в ммолях. триглийхзрида i на 1 л пробы. 5 Повторяя определения с разл1гчными количествами триглииерида в сыворотке, получают прямую. Пропорциональрость (коэффициент корреляции) 0,997. П р и м е р 2. Для сравнения реакти ва согласно изобретению с известным проводят следующие опыты. Опыты 1 и 2, Смешивают 4,9 мл раствора 1, который состоит из 0,1 М натрийфосфатного буфера, рН 7,6, содержащего 4 ммоль сульфата магния, 1,5мг альбумина , сыворотки и 0,01% додецилсульфата натрия; 0,2 мл раствора 2, состоящего из кс4)ерментной смеси 6 ммол НАНД, 33 ммоль аденозинтрифосфата (АТФ) и 11 моль фосфоенолпирувата (ФЕП 0,1 мл раствора 3, который включает 2 2 мг/мл ЛДГ и 1.МГ/МЛ ФК, в форме суспензии в растворе сульфата аммония;, раствор 4, состоящий из коферментной смеси 0,2 мг липазы из Rfi-izopUS Ql rllizus и 4,0 мг карбоксилэстеразы; 0,1 мл сыворотки (примерно 5О мг три глицерида). От полученного раствора от бирают 1,5 мл в кювету 1, остальное в кювету 2, Опыты 3 и 4. Смешивают 5 мл реактива 1 по примеру 1; 0,1 мл реактива 2 по примеру 1; О,1 мл реактива 3 по приме ру 1 и 0,1 мл сыворотки {как в опытах 1 и 2). От приготовленного раствора отбирают в кювету 3 2,5 мл, остальное в кювету 4. Через примерно 20 мин отбирают пипеткой в каждую из кювет 1 и 3 по 0,01 мл суспензии ГК, Кюветы 2 и 4 остаются для контрольной пробы. Ниже приведены полученные результаты. Найдено после оценки с контрольной пробой 517 мг триглицерида /100 мл, сыворотки. Через 1О мин после оценки контрольной пробой найдено 508 мг триглицерида/ 1ОО мл сыворотки. Найдено после оценки без контрольной пробы 477 мг триглицерида/100 мл сыворотки. Через 10 мин после оценки без контрольной пробы найдено 513 мг триглицерида /1ОО мл сыворотки, С реактивом согласно изобретению получают практически идентичные величины при измерениях с учетом и без учета контрольной пробы, С известным реактивом получают различ1гые величины (за счет появления мути), разница определений в данном примере около 8%. 4 Непосредственно после прибавления пробы загрузки во всех опытах почти прозрачны. В кюветах 1 и 2 через 5мии образуется заметная муть, В кюветах 3 и 4 через 0,5 мин раствор становится прозрачным. Через 55 ин раствор в кювете 4 все еше прозрачен, а в кювете 3 очень мутен. П р и м 8 р 3. Для приготовления согласно изобретению используют:1) раствор буфера; 0,02 М фосфат натрия в качестве буфера, рН 7,0, содержащего 3 ммоль сульфата магния, 0,01 мг/мл додецилсульфата натрия, 0,015 мг/мл цетилстеарилалкоголь- полигликольэфира с 12 ммоль этиленоксида и 0,1 мг/мл альбумина плазмы; 2)смесь коэнзимов, как в примере 1; 3)смесь ферментов; 0.2 Л1тааы из RtlizopUS ahrtlizus 0,2 мг/мл ФК (из мускулов кролика), 0,2 мг/мл карбоксилэстеразы (из микроорганизмов), 0,5 мг/гл ЛДГ (из сердцу свиньи или мускулов свиньи или кролика) в виде кристалл1П1еской суспензии; 4) 0,05 мг/мл ГК в виде кристаллической суспензии. Смесь реактивов приготавливают по примеру 1, исследование проводят так же, как в примере 1. При исследовании 1О сывороток человека и 3 контрольных сьшороток получено хорошее совпадение результатов с результатами, пол 1енными в примере 1. Коэффициент корреляции 0,991, П р и м е р 4, Для притотовления реактива согласно изобретению применяют:1)буферный раствор --0,1 М фосфат натрия в качестве буфера, рН 7,0, содержащего 8 ммоль суль4)ата магния, 0,2 мг/мл додешшсульфата натрия, 0,3 мг/мл цетилстеарилалкогольполигликольэфира с 12 моль этиленокснда, 2,0 мг/мл альбумина сыворотки; 2)смесь коферментов; 20 ммачь НАДИ, 100 ммачь АТФ, 20 ммоль ФЕП в Д15стиллированной воде; 3)смеси ферментов: 1О мг/мл липазы из RtlizopUS arrliizuu , 20 мг/мл карбоксилэстеразы (яз мпкрооргаиизмов), 5 мг/мл ФК (из мускулов кролийа), 5 мг/мл ЛДГ (из сердца CBHtibH или мускулов свиньи или кролика), как раствор в буфере; 4) 5 мг/мл ГК.