Способ получения полимера,содержащего звенья - О.СН(СН @ )СН @ СО- Советский патент 1988 года по МПК C12P7/42 C12P7/42 C12R1/05 

и

. Изобретение относится к биотехнологии и касается получения термопластичного полиэфира повторяющейся структуры О. СН(СН,з)СН2СО - (1), который быстро кристаллизуется до относительно высокого уровня (порядка 70% или более) и представляет собой поли -гидроксимасляну1о кислоту (РНВ) Цель изобретения повышение термопластичности полимера за счет понижения его кристалл1танссти и хрупкое-

ТИо

Способ закгаочается в следующем.

В качестве микроорганизмов, продуцирующих поли--р -оксимасляную кислоту, используют кулрзтуры, способные а.ссрмилировать кислоту или ее соль. Предпочтительными являются штаммы или мутанты бактерий Alcaligenes eutrophus №№ КС IB 11600, NCI В 11599s NCIB 11598, NClB 11597, ATCC 17699 и штаммы бактер1ет Nocardia salmonicolor №№ ATCC 19149 и ATCC 21243.

I

Ферментацию проводят таким образом, чтобы сухой вес полиэфирсодержа- щих клеток составлял не менее 5 г/л водной среды. Чтобы получить,, например,, 10 г/л РНВ--содержащих клеток с содержанием РНВ порядка 40 мас,%, количество питательных веществ, подаваемых в ферментер для ограничения роста клеток, устанавливают из расчета по ддерлсания роста б г/л клеток,, не содержащих РНВ. Напримерj если используют азот в качестве ограничиваю™ щего рост питательного вещества, то содержание азота в свободных от РНВ бактериальных клетках должно соста:в- лять 8-15 мас,%, прг-гчем требуемое количество ассш-п-шируемого азота должно составлять О,, 5-0,9 г/л, например 0,6 1,2 г ионов аммония на 1 литр.

Подходящие кислоты-субстраты долж- ны быть растворимы в воде и поэтому могут добавляться как таковые или в виде водно-растворимой соли щелочного металла. Предпочтительными являются пропионовая и изомасляная кислоты гидрокси-замещенныЁ производные этих кислот и масляной кислоты например 3-хлорпропионовая, З-гидроксипропио- новая5 а также ненасьщенные кислоты или их гадо-замещенные, такие как акриловая, метакриловая, 2-хлорпропи- оновая кислоты. Используемые кислоты должны давать начало не только повторяющимся звеньям (I), когда ку,льтиви-

рование проводят в состоянии ограничения роста.

Полимер образуется в виде гранул внутри клеток микроорганизма. Клетки, содержащие полимер, могут быть использованы в качестве формовочного полимера. Желательно отделять полимер от клеток путем их расщепления с после- дующей экстракцией подходящим растворителем,

Вьщеленный полимер имеет молекулярную массу от 100 000 и выше 200 000.

При нормальном метаболизме субст рата, например пропионата, последний превращается в сугсдинат, который да- . ет начало ацетил СоА путем окисления элемента трикарбоновой кислоты, ТСА, цикла Кребса, в щавелевоуксусную кислоту с последующим декарбоксилирова- нием. При декарбоксилированик щавеле- воуксусной кислоты обе концевые кислотные группы удаляются в виде окиси углерода Следовательно, если пропионат, имеющий атом углерода в

карбоксильной группе, который радиоактивно мечен5 т. е, 1-С -пропнонаТд подается к клеткам то превращение его в ацетил Со А будет осуществлять- ся с одновременной потерей радиоак-

1-1

СО,

Любое внедрегтивности в виде ov., ние, С в должно быть р езуль- татом превращения пропионил СоА в р П Щроксивалерил СоА и последующей полшчеризации ,1

П р и м е р 1в Мутант Alcaligenes eutrophus NCIB 11599 выращивают в аэробных условиях в 5-литровом периодическом ферментереS содержащем сре- ды следующего состава на 1 л деиони- зированной воды;

Глюкоза

(NH)2SO

MgSO,-7H О

HjPO(,lM)

FeSO . 7Н ,,0 Следы элементов

г 2,0 г 0,8 г 0,45 г 1 2 мл 1 5 мг 24 мл

Раствор микроэлементов:

CuSO

0,02 0,1 OJ 2,6

ZnSO,

MnSO

СаС1.2Н,,0

При достижении концентрации кле ток 4,5 г/л5 т,е, по истощении ассимилируемого источника азота, в среду вносят 1 г/л пропионата натрия, со держащего 1-С -пропионат, совместно с глюкозой и ферментацию продолжают

в течение 5 мин. Клетки отделяют фильтрацией и полимер экстрагируют хлороформом. Меченый углерод обнаруживают исключительно в хлороформном растворе. Это указьшает на то, что меченые концевые атомы углерода не теряются в виде двуокиси углерода. Следовательно, некоторое количество пропионата внедрилось в полимер, от- личный от ацетил СоА,

Содержание полимера в клетках 60% Т.пл. 122°С, Зона зндотермы плавления 51 Джгч ,

Пример 2. Мутант Alcaligenes eutrophus NCI В 11599 выращивают в ус ловиях аэрации при рН и 34°С в 5-литровом ферментере периодического действия, содержащем 4000 г-ш водной среды, содержащей на л деионизиро- ванной воды: .

(Шр,, г

MgSO 7Н О 0,8 г

0,45 г

12 мл 1 5 мл

Раствор микроэлементов по

примеру 1) 24 мл

Глюкозу добавляют со скоростью 8 г/ч. Количество ассимилируемого азо ,та в среде достаточно для образования 26 г/л несодержащих клеток поли- й-гидроксимасляной кислоты (РНВ),

Через 40 ч клетки отделяют центри фугированием, сушат вымораживанием и экстрагируют хлороформом,

Содержание полимера в клетках 70% Т.пл. 91°С. Зона эндотермы плавления 127 Дж-ч .

П р и м е р 3, Процесс ведут как в примере 2 за исключением того что при достижении концентрации клеток 34 г/л в ферментационную среду добавляют пропионовую кислоту вместо глю- козы со скоростью 2 г/ч. Количество полимера в клетках 70%.

KjSOj, HjPO FeSO .7Н О

П р и м е р 4. Процесс ведут как в примере 3 за исключением того что в момент достижения концентрации клеток 28 г/л в ферментационную среду вместо глюкозы со скоростью 2 г/ч добавляют изомаслянзпо кислоту в виде раствора, содержащего 150 г/л кислоты Ферментацию ведут до достижения концентрации клеток 26 г/л РНВ с добавлением глюкозы.

Содержание полимера в клетках 50%,

-

о

0

5

0

5

П р и м е р 5. Процесс ведут как в примере 4 за исключением того, что при достижении концентрации клеток 30 г/л в ферментационную среду подают 4 г 3-хлорп.ропионовой кислоты в концентрации 50 г/л и продолжают ферментацию в течение 7 ч при постоянном добавлении глюкозы со скоростью 6,8 г/ч.

Количество полимера в клетках 35%. П р и м е р 6. Способ осуществляют согласно примеру 2 за исключением того, что при достижении концентрации клеток 31 г вместо глюкозы в среду в течение 5 ч добавляют акриловую кислоту со скоростью 4 г/ч с концентрацией 100 г/л.

Содержание полимера в клетках 25%. Б полученных полимерах определяют количество сомономерных звеньев гид ролизом и газовой хроматографией методом .

Молекулярные массы полимеров определяют методом гельпроникаемой хроматографии о

Полученные результаты представлены в табл Л

Приме р 7. В 5-литровый ферг- ментер зэ,грзпкают 3 л среды следующего состава на 1 л деионизированной воды: (NH),SO,6,2 г

Н,(1,Ш) 1,5 мл MgSO г .THgO 15 мг Раствор микроэлементов (как в

примере 1) . 36 мл Ферментер инокулируют выдержанной в течение 48 ч во встряхиваемой колбе культурой мутанта Alcaligenes eutrophus NCIB 11599, а затем добавляют 5 г/л глюкозы. Ферментацию про- водят аэробно при и регулируемой величине рН 6,8 автоматически с помощью добавления 9;1 объем/объем смеси 4м КОН и 4М NaOH. Количество фосфора достаточно для поддержания 8 г/л РНВ клеток свободных от полимера о

Когда вся глюкоза утилизировалась (на этой стадии концентрация клеток около 2,5 г/л), добавляют пропионовую кислоту в виде раствора, содержащего 300 г/л пропионовой кислоты, со скоростью 0,-8 г/ч в течение 54 ч. j

Затем клетки собирают, полимер экстрагируют хлороформом, и анали-

зируют. Получают следующие результа ты: конечная концентрация клеток 20 г/л; содержание полимера 60% по весу.

Полимер содержит 60 моль % бета- оксибутиратных звеньев и 40 моль % бета-оксивалератньк звеньев (т.е., где R этил).

Примере. Мутант Alcaligenes eutrophus NC1B 11599 выращивают при аэробном культивировании при рН 6,8 и 34°С в 5-литровом ферментере, содержащем 4000 мл водной среды, имеющей следующий состав на один литр деионизированной воды:

Глюкоза17 г

(NH) 80 . 4 г

MgSO 7Н О 0,8 г

HjPO (1,Ш) 12 мл

FeSO 15 мг

Раствор микроэлементов (как

в примере 1) 36 мл

Величину рН поддерживают на уров- не 6,8 с помощью автоматического добавления смесей 9:1 объем/обьем 4 М гидроокиси калия и 4 М гидроокиси натрия. Данное добавление смеси КОН/ NaOH для регулирования рН служит так- же для снабжения среды для культивирования калием и натрием.

Количество ассимилируемого азота (обеспечиваемое применением 4 г/л сульфата аммония) бьшо достаточным для поддержания около 6,5 г/л РНВ ; клеток свободных от полимера.

Так как для получения 6,5 г/л клеток полимера требуется 16 г/л глюкозы, присутствующее количество глюко- зы бьшо достаточным для обеспечения небольшого избытка углерода.. С помощью регулирования концентрации остаточной глюкозы, а также следов давления растворенного кислорода получа- ют ясное указание того, когда системе становится недостаточно ассимилируемого азота. На этой стадии начинают подачу 3-оксипропионовой кислоты в двух экспериментах и 2-окси-масляной

кислоты в третьем эксперименте.

I

После завершения добавления кислоты клетки собирают с помощью центрифугирования . Образец центрифугирован- ных клеток сушат замораживанием и полимер экстрагируют хлороформом. Полимер анализируют с помощью технологи-

0

5 о

,

Q 5

5

5

ческих приемов газовая хроматография/ масс-спектроскопия (ГХМС).

Результаты представлены в табл.2. Примеры 9-13. В каждом примере 250 мл встряхиваемой колбы загружают 50 мл водной среды, содержащей на 1 л деионизированной воды: Глюкоза10 г

,1,9 г

NaH.,56 г

(NH),8 г

MgSO 7Н О0,2 г

FeCl бНТ)0,001 г

Раствор микроэлементов (как в примере 1) 1 мл Величина рН водной среды 7,0. Колбу инокулируют Nocardia salmonico- lor и осуществляют вьфащивание при вращающемся (гироскопическом) встряхивании при в течение 24 ч. Полученную в результате суспензию затем центрифугируют. Массу клеток, полученную в результате центрифугирования, затем повторно суспендируют в 50 мл водной среды, идентичной ( среде, указанной выше, за исключением того, что 10 г/л глюкозы заменяют 1 г/л кислоты, а 1,8 г/л сульфата аммония не вносят. Повторно суспендированные клетки встряхивают в течение 24 ч при 30°С, а затем суспензию клеток центрифугирзтот. Центрифугированную лепешку или таблетку клеток промьшают дважды метанолом и анализируют на содержание полимера. Полимер анализируют с помощью газовой хроматографии/масс-спектроскопии. Результаты представлены в табл.3. Более высокие содержания полимера могли быть получены при добавлении дополнительного количества кислоты после культивирования повторно суспендированных клеток в течение 24 ч и продолжении культивирования.

П р и М е р 14. Мутант A.eutro- phus ClB 1 1599 выращивают путем аэроб-| ного культивирования при рН 6,8 и 34°С в 5-литровом порционном ферменI

тёре, содержащем от 3500 до 4000 мл водной среды, содержащей на один литр деионизированной воды: Глюкоза18 г

(NH), г

MgSO 7Н,0 0,8 г (1,1М) 12 мл FeSO 7Н,0 15 мг

713

Раствор следовых

элементов, тех же,

что в примере 1 36 мл

рН регулируют на уровне 6,8 путем автоматического добавления 9:1 об./об смесей 4 М хлористого калия и 4 М едкого натрия..Это добавление смеси KOH/NaOH регулирования рН служит для подачи в ростовую среду калия и нат- рия.

Количество ассимилируемого азота обеспечивают 4 г/л сульфата акмоккя достаточным для поддержания всего примерно 6,5 г/л свободных от поли- меров клеток НВ.

Поскольку для получения 6,5 г/л свободных от полимера клеток требуется примерно 16 г/л глюкозы, количества присутствующей глюкозы достаточно для обеспечения небольшого избытка углерода.

Когда концентрация клеток достигает 8,0 г/л в течение 4,5 ч добавляют 1 г/л 2-оксимасляной кислоты, а затем клетки собирают путем центрифугирования. Пробу этих клеток высушивают замораживанием и с помощью хлороформа экстрагируют полимер. Содержание полимера в клетках 24%. Тем пература плавления 174 С, зона эндо-термы плавления ПО Дж-г .

Пример 15. В этом примере водная среда и условия ферментации, т.е. рН, температура те же самые, что и в примере 14, за тем исключе нием, что концентрация глюкозы составляет 16 г/л и используют лабораторный ферментер непрерывного действия с рабочим объемом 2 л (приблизи- тельно). Непрерывные условия культивирования -устанавливают путем непре- рьшной подачи в ферментер водной среды и непрерьтного удаления соответствующего количества среды из фермен- тара, обеспечивая среднее время пре- .бьшания 12,5 ч (т,е. скорость разведения 0,08 ч М« Затем вводят 3-гид- роксипропионаэую кислоту в количестве 4,4 г на литр водной среды.

После достижения стабильного состояния содержание остаточной глюкозы составляет 0,6 г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота меньше I мг/л и концентрация клеток составляет примерно 10 г/л.

Полимер собирают из удаленной из ферментера среды путем центрифугирования, сушки замораживанием и экст

5

0

5 О

О 5 Q

5

5

438

ракции посредством хлороформа. Содержание полимера в клетках 33%. Т.пл. . Зона эндотермы плавления 106 Дж г

П р и М е р 16. Повторили пример 15 за тем исключением, что скорости питания регулируют так, чтобы среднее время пребьшания составляло 11,8 ч (т.е. скорость разведения 0,095 ч ), и добавляют 3-гидрокси- пропионовой кислоты в количестве 2,8 г/л.

После достижения стабильного состояния остаточное содержание глюкозы 0,3 г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота составляет меньше 1 мг/л, а концентрация клеток составляет примерно 9 г/л.

Содержание полимера в клетках 28%. Т.пло 166°С, зона зндотермы плавления i 00 Дж г

Анализ определяет температуру стеклования аморфной фазы. Зоны эндо- терм плавления указьшают на относительную степень кристалличности.

Полимеры из примеров А, В, и С были подвергнуты анализу ядерной магнитно-резонансной спеггтроскопией С. Поведение полимеров при плавлении определяют путем дифференциальной калориметрии со сканированием (DSC) на отожженных образцах, полученных путем формовки сжатием при 190°С.

Полученные полимеры после отжига обладали значительно меньшей степенью кристалличности, чем контроль- ньш сополимер из примера 2.

Формула изобретения

1. Способ получения полимера, содержащего звенья - 0,CH(CHJCH,CO-, путем культивирования микроорганизма, способного продуцировать поли-р-окси- масляную кислоту, в водной питательной среде, содержащей в течение всего периода культивирования или его части органическую кислоту, или ее производное в качестве ассимилируемого источника углерода и ассимилируемые источники азота и фосфора, отличающийся тем, что, с целью повышения термопластичности за счет понижения его кристалличности и хрупкости, культивирование ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем процесс про- при использовании от 4 до

913751

100 мас.% ассимилируемого источника ,углерода в виде глюкозы или пропионо- вой, или изомасляной,-ИЛИ акриловой или 3-оксипропионовоЙ4 или 3-хлорпро- - пионовой, или 2-оксимасляной кислоты, или их водорастворимых солей щелочных металлов,до накопления продуцентом от 20 до 70 мас.% получаемого полимера.10

2. Способ ПОП.1, о тличаю- щ и и с я тем,.что процесс культивирования после ассимиляции азота

310

и/или фосфора ведут при использовании в качестве источника углерода смеси глюкозы и одной из вьшеуказан- ных органических кислот или ее соли при содержании в смеси данной кислоты или соли 4-75 мас.%,

3. Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что процесс культивирования до полной ассимиляции азота и/или фосфора ведут при использовании глюкозы в качестве источника углерода.

ч

Таблица 1

Изобретение позволяет обеспечить получение полимера, содержащего звенья -О. СН(СНд)СН„СО - с пониженной кристалличностью и хрупкостью. Процесс ферментации продуцирующих поли- -оксимасляную кислоту микроорганизмов в водной питательной среде ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем в ферментационную среду вводят 4 - 100 мас.% ассимилируемого источника углерода, культивирование продолжают до накопления продуцентом 20-70мас.% получаемого полимера. В качестве ас- сими.пируемого источника углерода используют кислоты: пропионовую или изомасляную, или акриловую, или 3-ок- снпропионовую, или 3-хлорпропионовую, или 2-оксимасляную или их водорастворимые соли щелочных металлов. Анализ полученных полимеров, выделенных из клеток бактерий, показьшает снижение зоны эндотерм плавления, что указьша- ет на снижение кристалличности и хрупкости полимера. 2 з.п.ф.,3 табл. (Л Од сл 4: оо

Нет

Пропионовая

Изомасляная

3 Хлорпропи- оновая

Акриловая

О

27

30

2 0,6

.6,5

Кислота

З-Оксипро- пионовая

2-Оксимасля- ная

Таблица 2

этил и водород , в обоих случаях

этил

11

19149 19149 21243 21243 21243

Изомасляная

2-Хлорпропионовая

Пропионовая

Изомасляная

2-Хлорпропионовая

Примечание. - бета- чэксибутиратные единицы;

З-НУ - бета-оксивалератные единицы.

137514312Таблица 3