Способ получения 2-кето-D-глюкаровой кислоты Советский патент 1992 года по МПК C12P7/50 C07C59/105 

Изобретение относится к технической микробиологии и касается способа получения 2-кето-О-глюкаровой кислоты, которая может быть использована в качестве добавки к корму для приготовления детергентов, пластификаторов цемента и в качестве реагента при изучении метаболизма сахаридов.

Известен способ получения 2-кето-О- глюкаровой кислоты микробиологическим окислением D-глюкаровой кислоты действием микроорганизма Pseudomonas aeruglnosa. D-глюкаровую кислоту получают из глюкозы химическим окислением.

Недостатком известного способа является высокая стоимость целевого продукта.

Цель изобретения - удешевление вого продукта.

В качестве предшественника 2-кето-О- глюкаровой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы

R2

но-с-н

НгС-ОН

н-с-он снг-он

где Ri, -СНО, -,СН2ОН, -СООН,

R2 НСОН, НОСН ,- СО,

а окисление проводят штаммами бактерий

Pseudogluconobac.ter saccharoketogenes

K591c(FERM BP-1130, IFO 14464), или 12-5

(FERM BP-1129, IFO 14465), или ТН14-86

XI (Л GO О N О

Сл

(PERM BP-1128, IFO 14466), или 12-5 (PERM BP-1132, IFO 14482), или 124-4 (PERM BP- 1131, IFO 14483) или 22-3 (PERM BP-1133, IFO 14484) при 23-35°С, рН 6,0-7,5 в течение 50-100 ч и содержании указанных моносахаридов или их производных в среде 5-20 мас/обьем.

Штамм К591 и штаммы 12-5,12-15, 12- 4 и 22-3 выделены из образцов почв, собранных в префектурах Япония - Вакагама и Сига. Каждый неуказанных штаммов имеет следующие таксономические признаки.

Таксономические характеристики штаммов К591с и 12-5.

Морфология,

Клетки палочковидные размером 0,3- 0,5 х 0,7-1,4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные, имеют порядка 2-4 полярно расположенных жгутика. Споруляиия не обнаружена. Грамотрица- тельные. Некислотостойкие.

Рост на различных средах.

Питательный агар: рост слабый. На питательном агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную, гладкую, опа- лесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити, гладкие, опалесцирующие. Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени, По всей поверхности среды образует однородную мутность.

Столбик желатины с питательной средой: рост слабый, только в верхней части. Разжижения желатины не происходит. Лакмусовое молоко окисляет. Коагулирует.

Физиологические признаки.

Восстанавливают нитрат, хотя слабо; денитрификация не обнаружена. Положительная проба метилкрасного. Индол и сероводород не образуются. Крахмал не гидролизуется. Цитрат не утилизируется. Соли аммония утилизируются. Пигментооб- разования не обнаружено. Образует уреазу. Оксидазоположителен. Каталазоположителен. Растет в интервале 1б-Зб°С. Оптимальная температура составляет примерно 24-34°С. Растет в пределах рН 5,5-8,7. Оптимальное значение рН составляет примерно 6,0-7,5.

Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из L-араби- нозы, D-ксилозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-галактозы, D-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы, D-маннита и глицерина. Не образует ни газа, ни кислоты из D-сорбита, инозита или крахмала.

Другие характеристики.

Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от

биотина, тиамина, рибофлавина и кофер- мента А (далее СоА). Образует диоксиацетон из глицерина. Содержание гуанина цитози- на в ДН К составляет примерно 67 + 1 мол. %,

Содержит убихинон (кофермент Q) с 10 изо- преновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину.

Таксономические признаки штамма 12- 15.

Морфология.

Клетки палочковидные размером примерно 0,3-0,5 х 0,7-1,4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные, имеют порядка 2-4 полярных жгутика, Споруляция не обнаружена. Грамотрицатель- ные. Некислотостойкие.

Рост на различных средах. Питательный агар: рост слабый. При культивировании на питательном агаре на

дрожжевом экстракте образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити ровные, опалесцирующие.

Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует одинаковую мутность по всей поверхности среды. Столбик питательного желатина: рост слабый, только в верхней части. Разжижения желатина не происходит. Лакмусовое молоко окисляет, коагулирует.

Физиологические характеристики. « Нитрат не восстанавливает. Денитри- фикация не обнаружена. Положительная

проба метилкрасного. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразования не обнаружено. Образует уреазу, Оксидазоположителен.

Каталазоположителен. Растет в интервале 23-32°С. Оптимальная температура составляет примерно 28-32°С. Растет в пределах рН 6,0-7,5. Оптимальное значение рН составляет примерно 6,5-7,1.

Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из L-арабино- зы, D-ксилозы, D-глюкозы, D-фруктОзы, D- галактозы, D-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из D-маннита, D-сорбита, инозита или крахмала.

Другие характеристики. Образует уксусную кислоту из этанола, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и СоА. Образует диоксиацетон из глицерина. Содержание гуанинан цитозина в ДНК составляет порядка 67 + 1 мол.%. Содержит убихинон

с 10 изопреновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину.

Таксономические

признаки штамма12-4,

Морфология.

Клетки палочковидные размером 0,3 0,5 х 0,7 1,4 мкм. Полиморфизма клеток не обнаружено. Клетки подвижные, имеют 2-4 полярных жгутика. Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные. Некислотостойкие.

Рост на различных средах.

Питательный агар1 рост только очень небольшой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательном агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирую- щую колонию.

Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени, образует нити ровные, опалесцирующие. Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени с образованием однородной мутности по всей поверхности среды. Столбик питательного желатина: рост скудный, только в верхней части. Желатин не разжижается. Лакмусовое молоко окисляется, но не коагулирует.

Физиологические характеристики.

Не восстанавливает нитрат. Денитри- фикация не обнаружена. Положителен в пробе метилкрасного. Индол не образует. Сероводород образует. Крахмал не гидро- лизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразование не обнаружено. Образует уреазу. Оксидазополо- жителен. Каталазоположителен.

Растет в интервале 16-36°С, оптимальная температура составляет 24-34°С. Растет в интервале значений рН 5,5-8,2. Оптимальное значение рН составляет 6.0- 7,5.

Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из L-араби- нозы, D-ксилозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-галактозы, D-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоту, ни газ из D-маннита, D-сорбита, инозита или крахмала.

Другие характеристики.

Образует уксусную кислоту из эталона, хотя в количестве следов. Рост зависит от биотина, тиамина, рибофлавина и СоА или пантотеновой кислоты. Образует диоксиа- цетон из глицерина. Содержание гуанина + цитозина в ДНК составляет порядка 67+1 мол.%. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину.

3.

Таксономические признаки штамма 22Морфология.

Клетки палочковидные размером 0,3- 0,5 х 0,7-1,4 мкм. Полиморфизм клеток не обнаружен. Клетки подвижные с 2-4 полярными жгутиками. Споруляция не обнаружена. Грамотрицательные. Некислотостойкие. Рост на различных средах.

Питательный агар: рост только очень небольшой колонии, полный обзор невозможен. При культивировании на питательном агаре с дрожжевым экстрактом образует круглую, сплошную, гладкую, опалесцирующую колонию. Скошенный питательный агар с дрожжевым экстрактом: рост средней степени. Образует нити ровные, опалесцирующие.

Жидкая питательная среда с дрожжевым экстрактом: рост средней степени с образованием одинаковой мутности по всей поверхности среды. Столбик питательного желатина1 рост скудный, только в верхней части. Разжижение желатина не происходит Лакмусовое молоко окисляет, но не коагулирует

Физиологические характеристики. Восстанавливает нитрат, хотя слабо. Денитрификация не обнаружена. Положительная проба с метилкрасным. Индол и се- роводород не образует. Крахмал не гидролизует. Цитрат не утилизирует. Утилизирует соли аммония. Пигментообразование не обнаружено. Образует уреазу.

Оксидазоположителен. Каталазоположителен. Растет в интервале 16-38°С, оптимальная температура составляет 24-34°С. Растет в интервале рН 5,5-8,7. Оптимальное значение рН составляет 6,0-7,8.

Аэроб.

Образует кислоту, а не газ из L-арабино- зы, D-ксилозы, D-глюкозы. D-фруктозы, D- галактозы, D-маннозы, мальтозы, сахарозы, лактозы, трегалозы и глицерина. Не образует ни кислоты, ни газа из D-маннита, D-сорбита, инозита и крахмала. Другие характеристики. Образует уксусную кислоту из этанола. хотя в количестве следов. Рост зависит от

биотина, тиамина, рибофлавина и СоА или пантотеновой кислоты. Образует оксиаце- тон из глицеринч. Содержание гуанина + цитозина в ДНК составляет порядка 67 + 1 мол.%. Содержит убихинон с 10 изопреновыми единицами (Со Ою). Устойчив к стрептомицину.

Штаммы К591с, 12-5,12-15,12-4 и 22-3 не принадлежат к известным родам, а представляют новый бактериальный вид нового

рода, названный Pseudogluconobacter saccharoketogenes.

Указанные бактериальные штаммы в некоторых случаях обозначаются как окисляющие бактерии. Их потребности в пита- ним для роста следующее.

У штаммов К519с, 12-5, 12-15 необычные потребности в питании, т.е. для роста им необходим СоА. В указанных трех штаммах кофермент А нельзя заменить пантоте- новой кислотой. Штаммы 12-4 и 22-3 могут расти в присутствии СоА и/или пантотено- вой кислоты.

Бактериальные штаммы включают также мутанты, полученные путем облучения указанных штаммов ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами или обработкой их химическими мутагенами, например М-ме- тил-М -нитро-М-нитрозогуанидином (нитро- зогуанидином), метилметансульфонатом или азотсодержащей горчицей.

Примером мутанта является штамм ТН14-86, который получен из штамма К591с путем обработки нитрозогуанидином. Этот штамм имеет таксономические характери- стики, аналогичные материнскому штамму, за исключением того, что он обнаруживает повышенную способность образовывать 2- кето-0-глюкаровую кислоту из сахаридов.

Штаммы К591с, 12-5, 12-15, 12-4, 22-3 и ТН 14-86 сданы на хранение в Институт по ферментации, Осака (IFO), а также в Исследовательский институт ферментации (FERM) Агентства Промышленной науки и технологии Министерства международной торговли и промышленности. На основании Будапештского Договора указанные микроорганизмы хранятся в FRI,

Депозитарные номера микроорганизмов представлены в табл.1.

Соединения, которые используют в изобретении в качестве предшественника, включают D-глюкозу, D-фруктозу, D-манно- зу, D-сорбит, D-маннит, D-глюконовую кислоту, 2-кето-О-глюконовую кислоту, D-глюкозон и О-манноновую кислоту (указанные соединения далее сахариды).

Сахариды можно вводить в среду либо вначале культивирования несколькими порциями, либо непрерывно в течение всего процесса культивирования. Концентрация сахаридов в реакционной жидкости должна5 составлять 5-20 мае. %/объем.

В реакционной жидкости значение рН устанавливают в пределах 5,5-7,5. Темпера- туру и время реакции окисления поддерживают в интервале примерно 23-35оС и около 50-100 ч. Культуральная среда может быть либо жидкой, либо твердой. В среду включают источники углерода, азота, минеральные и органические кислые соли и питательные вещества в количестве следов. Сахариды можно использовать в качестве источников углерода без обработки. Как дополнительные источники углерода могут быть использованы глицерин, сахароза, лактоза, мальтоза, меласса.

В качестве источников азота в среду включают соли аммония (сульфат, нитрат, хлорид, фосфат), кукурузный экстракт (далее CSL), пептон, мясную вытяжку, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, соевую муку, муку из семян хлопка и мочевину. Минеральные соли включают соли калия, натрия, кальция, магния, железа, марганца, кобальта, цинка, меди.

Питательные вещества, ко.торые используют в количестве следов, включают витамины, необходимые для роста указанных бактерий, например СоА, пентотеновую кислоту, биотин, тиамин и рибофлавин, а также соединения со стимулирующим действием на рост бактерий и продуцирование 2-кето-О-глюкаровой кислоты,, например флавин-мононуклеотид (ФМН), флавин-аде- ниндинуклеотид (ФАД), другие витамины, L- цистеин, L-глутаминовая кислота и тиосульфат натрия в виде либо химических соединений, либо природных вещес тв, которые их содержат.

Культивирование бактерий проводят методами статического культивирования, встряхивания в колбах, глубинного культивирования. Условия культивирования зависят от бактериального штамма, состава среды и других факторов. В качестве компонентов среды могут использоваться стерилизованные бактериальные культуры

Bacillus cereus IFO3131

Bacillus subtilis IFO3023

Bacillus pumilus IFO12089

Bacillus megaterium IFO12108

Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 Pseudomonas trifolii IFO12056

Citrobacter freundil IFO12681

Escherichia coli IFO3546

Erwlnia herbkola IFO12686

Культуру указанных бактерий высевают в соответствующую среду, выращивают при 20-40°С в течение четырех дней и после стерилизации полученный бульон добавляют в среду окисляющих бактерий в соотношении 0,5-5,0% (объем/объем).

2-Кето-0-глюкаровую кислоту, которая образуется и накапливается в реакционной жидкости, выделяют и очищают традиционными способами. При этом 2-кето-О-глюка- ровую кислоту получают в виде свободной кислоты либо соли натрия, калия, кальция, аммония, Например, бактериальные клетки

удаляют предварительно из реакционной жидкости фильтрацией или центрифугированием. В случае необходимости осуществляют обесцвечивание активированным углем. Затем раствор концентрируют до осаждения кристаллов. Образующиеся кристаллы собирают и перекристаллизовыва- ют.

Продукт, полученный согласно изобретению, идентифицирован как 2-кето-О-глю- каровая кислота путем определения физико-химических свойств (элементного состава, точки плавления, вращения плоскости поляризации) и ИК-спектра.

В результате высокоэффективной жидкостной хроматографии проведен количест- венный анализ 2-кето-О-глюкаровой кислоты. Подвижная фаза: разбавленная серная кислота. рН 2,2; скорость потока 0,5 мл/мин; детектор: дифференциальный рефрактометр; колонна с насадкой из сульфированного полистирольного геля (колонна типа SCR-101H, размер 7,9 мм х 30 см), В качестве стандартного образца использована известная 2-кето-0-глюкаровая кислота.

Изобретение позволяет получать 2-ке- то-О-глюкаровую кислоту с высоким выходом.

На фиг.1 и 2 показана инфракрасная область спектров поглощения кристаллического вещества, полученного в примере 1, и стандартного образца, полученного в контрольном примере.

П р и м е р 1 (контрольный). 30 мл среды, состоящей из, %: пептон 0,5; дрожжевой экстракт 0,5; D-глюкоза и К2НРСМ 1,0 (далее ПДГ-среда), помещают в200.мл коническую колбу и автоклавируют при 120°С в течение 20 мин. В указанную колбу вносят полную петлю свежих клеток Pseudomonas aeruginosa (IFO 3448), выращенных при 28°С в течение двух дней на скошенном агаре, который приготовили путем введения вереду ПДГ2% агара. Затем бактериальные клетки выращивают путем встряхивания с вращением (200 об, /мин) при 30°С в течение 24 ч. В качестве посевной культуры используют полученный культуральный бульон.

5 мае. %/объем водного раствора монокалиевой соли D-глюкаровой кислоты, предварительно доведенного до рН 7,0 с помощью NaOH, фильтруют через пористый фильтр с размером пор 0,45 мк для удаления микробов, после чего прибавляют его в ПДГ- среде до концентрации 1 мас.%/обьем. 1 мл указанного посевного культурального бульона переносят в 200 мл коническую колбу, содержащую 20 мл указанной среды, и выращивают с встряхиванием в течение 24 ч при 30°С. Как обнаружено в результате высокоэффективной жидкостной хроматографии, конечный культуральный бульон содержит 9,02 мг/мл 2-кето-О-глюкаровой кислоты. Для удаления бактериальных кле- ток указанный культуральный бульон (590 мл) центрифугируют и получают 580 мл над- осадочной жидкости. Образующуюся над- осадочную жидкость пропускают через колонку с катионообменной смолой IR 120 В

0 в Н+-форме, после чего для удаления катионов колонку промывают 150 мл деионизо- ванной воды. Далее надосадочную жидкость пропускают через колонку с активированным углем (70 мл), колонку промы5 вают 50 мл деионизованной воды, затем элюент (780 мл) доводят до рН 6,5 с помощью Са(ОН)2, после удаления белой мути фильтрацией его концентрируют до примерно 20 мл при пониженном давлении.

0 Образуемые в концентрате белые аморфные кристаллы собирают на стеклянный фильтр, промывают последовательно небольшими порциями холодной воды, метанола и этилового эфира и высушивают при

5 пониженном давлении. Получают 5,04 г 3,5- гидратированного дикальций-2-кето-0-глю- карата. Аналитические данные полученного продукта следующие.

Точка плавления: 152-157°С (разложе0 ние).

Данные элементного анализа: Вычислено %: С 23,30; Н 4,24; Са 12,96. СеНбОаСа 3.5Н20 Найдено, %: С 23,15; Н 4,18; Са 14,00.

5 Удельное вращение плоскости поляризации - +9.0° (с 1,075,0,1 н HCI).

ИК-область спектра поглощения: волновые числа главного поглощения имеют следующие значения:

0 волновое число, см-1: 3590, 3500-2700 (шир). 1650, 1600, 1430.

1380, 1360, 1300, 1250, 1240, 1220, 1125, 1095,

1065, 1040, 1005, 995, 900. 840, 800, 765,

5 725.

П р и м е р 2. 20 мл среды для посева, состоящей из 2,0% D-глюкозы, 1,0% пептона, 1,0% сухих дрожжей и 2,0% СаСОз, помещают в 200 мл коническую колбу и

0 автоклавируют в течение 20 мин при 120°С. В указанную колбу инокулируют одну полную петлю клеток штамма Pseudogluconobacter saccharoketogenes R591c (PER BP-1130, IFO ), выращен5 ных при 28оС в течение четырех дней на скошенном агаре, состоящем из, %: D-cop- бит 2,5; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; СаСОз 0,2 и агар 2,0, с последующим культивированием с встряхиванием (200 об./мин) при 30°С в течение двух дней с

получением культурального бульона с посевным материалом. Отдельно 200 мл среды, состав которой аналогичен указанной среде для посева, помещено в 1 л коническую колбу и простерилизовано при таких же условиях, как указано. После этого в указанную колбу переносят 10 мл культурального бульона с посевным материалом и затем проводят культивирование с встряхиванием при 30°С в течение трех дней.

Образующийся культуральный бульон содержит 19,4 мг/мл 2-кето-О-глюкаровой кислоты. Этот культуральный бульон (1600 мл) центрифугируют (7000 об./мин в течение 10 мин) для удаления осадка, содержащего бактериальные клетки, и получают 1520 мл надосадочной жидкости. После охлаждения до 4°С ее выдерживают в течение трех дней. Получают аморфные кристаллы 2-кето-О-глюкарата кальция. Образующиеся кристаллы собирают на стеклянном фильтре, промывают последовательно небольшими порциями холодной воды, метанола и этилового эфира, высушивают над пятиокисью фосфора при пониженном давлении. Получают 18 г тригидратированного дикальций-2-кето-глюкарата. Аналитические данные конечного кристаллического продукта следующие.

Точка плавления: 152-157°С (разложение).

Данные элементного анализа:

Вычислено, %: С 24,00, Н 4.03. Са 13,35.

СеНбОаСа ЗНаО

Найдено, %: С 23,96, Н 4,16, Са 13,00.

Удельное вращение плоскости поляризации света: +7,9° (с 1,065, 0,1 и НС).

ИК-область спектра поглощения:

волновое число, см :3590, 3500, 3400- 2700 (шир.),

1650,1600.1430, 1380, 1360,1300,1250,

1240, 1220, 1125, 1093, 10650. 1040, 1005.

995, 995, 900, 840, 800, 765, 725.

Указанное кристаллическое вещество и стандартный образец имеют одинаковый ИК-спектр (фиг.1 и 2 соответственно), одно и то же время удерживания (9,4 мин) при высокоэффективной жидкостной хроматографии и одинаковое отношение поглощения ультрафиолетовых лучей при 214 нм к показателю дифференциальной рефракции (примерно 1,0). Кристаллическое вещество и стандартный образец подвергают тонкослойной хроматографии при комнатной тем- пературе в течение 3 ч, используя целлюлозную пластину Мечск и смесь, состоящую из фенола, муравьиной кислоты и воды (75:5:25). Оба образца имеют одинаковое значение Rf. кроме того, проявляют себя одинаково в реакциях окрашивания: оба меняют цвет до черновато-коричневого, желтого и желтого при взаимодействии с

нитратом серебра, о-фенилендиамином и анилинофталевой кислоты соответственно. На основании указанных аналитических данных продукт идентифицирован как 2-ке- то-0-глюкаровая кислота.

Пример 3. Используя методику примера 2, готовят культуральный бульон штаммов К59-1С (PERM BP-1130, IFO 14464), 12-5 (PERM BP-1129, IFO 14465). 12-15 (FERM ВР-1132, IFO 14482), 12-4 (FERM BP-1131,

IFO 14483) и 22-3 (FERM BP-1133. IFO 14484).

Сбраживаемую среду получают путем добавления сахаридов при концентрации 5 мае. %/объем (табл.2), предварительно простерилизованных, в сред (рН 6,5), состоящую из, %: кукурузный экстракт 0,5; сухие дрожжи 0,5; сульфат аммония 0,5; сульфат натрия 0,05; сульфат железа 0,2 и СаСОз 3,0. 1,25 мл культурального бульона каждого

штамма переносят в 200 мл коническую колбу, содержащую 25 мл указанной среды, и культивируют с встряхиванием при 30°С в течение трех дней. Полученный культуральный бул ьон разбавляют 0,3 и серной кислотой и центрифугируют. После этого образующуюся надосадочную жидкость подвергают высокоэффективно жидкостной хроматографии для определения содержания 2-кето-О-глюкаровой кислоты.

В табл,2 представлен количественный выход 2-кето-Ь-глюкаровой кислоты (мг/мл).

Время удерживания при жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности и величина Rf при тонкослойной хроматографии полученного продукта равны 9,4 мин и 0,20 соответственно, что соответствует значениям стандарта.

П р и м е р 4. Среду (500 мл), состоящую

из 2,0% D-глюкозы, 1.0% пептона. 1,0% сухих дрожжей, 2,0% карбоната кальция и 0,01% актокола (антивспенивающий агент), помещают в двухлитровую колбу и автокла- вируют при 120°С в течение 20 мин. Бактериальные клетки штамма 12-5 (FERM BP-1129, IFO 14465), выращенные при28°С в течение четырех дней на скошенном агаре, суспендируют в 10 мл стерильной воды. Полученную суспензию переносят в указанную колбу, после чего проводят культивирование с встряхиванием (85 встрях./мин) при 28°С в течение двух дней с получением культурального бульона для использования в качестве посевной культуры.

Отдельно суспендируют в 10 мл стерилизованной воды бактериальные клетки Bacillus megaterium (IFO 12108), выращенные при 28°С в течение двух дней на скошенном агаре (состав среды описан в примере 2). Образованную суспензию ино- кулируют в колбе, в которой содержится такая же среда, после чего ее подвергают культивированию с возвратно-поступательным встряхиванием (84 встрях./мин) при 28°С в течение двух дней с получением куль- турального бульона Bacillus megaterium.

30 л среды (рН 7,0), состоящей из, %: сахароза 4,0; мука из семян хлопка 4,0; К2НР04 0,65; КН2Р04 0,55; сульфат аммония 0,05; NaCI 0,05; сульфат магния 0,05 и пан- тотенат кальция 0,05, помещают в 50-литровый ферментер и автоклавируют при 125°С в течение 20 мин. 1 л бульона с посевной культурой Bacillus megaterium помещают в указанный ферментер и культивируют в течение четырех дней при28°С и внутреннем давлении 1,0 кг/см2 в условиях аэрации с одновременным перемешиванием (200 об./мин). Полученный культуральный буль- он стерилизуют паром при 120°С в течение 20 мин, хранят в прохладном месте и используют в качестве стерилизованной куль- туральной жидкости Bacillus merjaterium как компонента сбраживаемой среды.

120 я сбраживаемой среды, состоящей из, %: D-глюкоза 10,0; пептон 1,0; сульфат железа 0,1; L-цистеин 0,01; карбонат кальция 6,08; 1 мкг/мл ФМН, 1 мкг/мл гидрохлорида тиамина, 0,5 мкг/мл биотина, 0.02% актокола и 4,0% указанного стерилизованного культурального бульона Bacillus megaterium, помещают в 200-литровый ферментер, стерилизуют при 125°С в течение 20 мин. 10 л бульона с посевной культурой по

мещают в ферментер и культивируют при 28°С и давлении 1,0 кг/см при аэрации 96 л/мин в течение четырех дней с перемешиванием при скорости 200 об./мин. Полученный культуральный бульон содержит 99,3 мг/мл 2-кето-0-глюкаровой кислоты.

0

5

0

5

0

5

0

5

Указанный культуральный бульон (110 л), очищенный в центрифуге (1500 об./мин), дает примерно 31 кг мокрого осадка. Его промывают 150 л воды, центрифугируют (3000 об./мин), суспендируют в 30 л ацетона, центрифугируют (3000 об./мин). Получают порошок белого цвета, который высушивают при 50°С в течение 24 ч при пониженном давлении. Степень чистоты полученного неочищенного порошка составляет 58,9% в расчете на свободную 2- кето-О-глюкаровую кислоту.

Формула изобретения Способ получения 2-кето-0-глюкаровой кислоты, включающий окисление предшественника 2-кето-0-глюкаровой кислоты действием микроорганизма в среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые вещества, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью удешевления целевого продукта, в качестве предшественника 2-кето-О-глюкаро-г вой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы

но-с-н I

н-с-он

I

н-с-он

I СН2-ОН

где Ri--CHO,-CH2OH,-COOH,

R2 HCOH, НОСИ, СО, а окисление их проводят штаммами бактерий Pseudogluconobacter saccharokelogenes K91c (PERM BP-1130, IFO 14464), или 12-5 (PERM ВР-1129, IFO 14465), или ТН14-86 (PERM BP- 1128, IFO 14466), или 12-15 (PERM BP-1132, IFO 14482), или 12-4 (PERM BR-1131, IFO 14483), или 22-3 (PERM BP-1133, IFO 14484) при 23-35°С. рН 6,0-7,5 в течение 50-100 ч и содержании указанных моносахаридов или их производных в среде 5-20 мае. %/объем.

Таблица 1

- Та б л и ца2

Изобретение относится к области технической микробиологии и касается способа получения 2-кето-О-глюкаровой кислоты, которая может быть использована в качестве добавки к корму, для приготовления детергентов, пластификаторов цемента и б качестве реагента при изучении метаболизма сахаридов. Цель изобретения - удешевV ление целевого продукта. В качестве предшественника 2-кето-6-глюкаровой кислоты используют моносахариды или их производные общей формулы Н ОН ОН I I l RV-RJ-C - С-С-СН2ОН , ОН Н Н, где, Ri -СНО, -СН2ОН, -СООН; R2-HCOH, НОСН,- СО . Окисление указанных соединений1 проводят штаммами бактерий нового вида Pseudogluconobacter saccharoketogenes К591с (PERM BP-1130, IFO 14464), или 12-5 (PERM BP-1129, IFO 14465), или ТН14-86 (PERM BP-1128. IFO 14466), или 12-15 (PERM ВР-1132, IFO 14482), или 12-4 (PERM BP-1131, IFO 14483), или 22-3 (PERM BP-1133, IFO 14484). Процесс окисления проводят при 23- 35°С, рН 6,0-7,5 в течение 50-100 ч. Содержание предшественника в среде 5-20 мае. %/объем. 2 ил,, 2 табл. (Л с

3500

зооо

2500

гооо moo 1боо Wavenumber ()

8олне &ое число fc/ч J Фиг.1

(2

(200

ЮОО

800 GSO

юо

зооо

2 SCO

пг

2000 1000

ieoo MOO $C/7f/c t C e ЧЧСЛО Фиг 2.

1000

BOO 650