Способ получения -лизина Советский патент 1980 года по МПК C12D13/06 

I

Изобретение относится к технике (получения L-лизина ферментацией микроорганизмов в культуральной среде, содержащей источник ассимилируемого микроорганизмом углерода, и может быть использовано в производстве кормов, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов.

Известен способ получения L-лизина путем выращивания продуцируюп1их его микроорганизмов ка питательной среде, содержащей источники углерод азота, неорганические соединения и стимуляторы роста с последующим выделением Ь-.лизина из культурально жидкости одним из известных способо например, при помощи ионообменных смол 1. Известный способ не обеспечивает высокого выхода L-лизина,

Целью изобретения является увеличение выхода L-лизина, а также получение лизина из углеводородов, как источника углерода, путем культивирования мутанта штамма микроорганизма, принадлежащего к роду Acinetobacter,

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения Ь-лизина в качестве микроорганизмов-продуцентов используют мутантные штаьмы

Acinetobacter calcoacetlcus АТСС 31024, АТСС 31025 и АТСС 31028, полученные из штамма Acinetobacter calcoaceticus № 38 АТСС 31023 предпочтительно ультрафиолетовым облучением.

При этом штаммы являются устойчивыт- и в среде к более чем 0,05% L-треонина и L-валина, или более чем 6,05-% L-валина.

Кроме того , штаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их аналогам, к комбинации аминокислот и их аналогов, при этом аминокислоты вы бирают из группы, включающей треонин, валин, метионин, лизин и серин, а аналоги аминокислот выбирают из группы, включаквдей норвалин, (Ь -оксявалин, -аминомасляную кислоту, сЛ. -амино- р -хлормасляную кислоту, 8 аминозтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокись метионина и гидроокись валина.

При этом в качестве стимулятора роста L-лизика используют поверхностно-активное вещество.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L-лизин микроорганиз1«5Ы, в качестве которых, используют мутантные штаммы Acinetobacter calcoaceticus АТСС 31024, АТСС 3.102 и АТСС 31028, пол 1енные из штамма Acinetobactar calcoaceticus 38 ЛТ 31023 ультрафиолетовым облучением выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азот неорганические соли и стимуляторы роста. Культура Acinetobacter calcoaceticus № 38 может быть также обработана таким мутагенным агентом, как нитрозогуанидин (К метил-Ы-нитро-Ы-нитрозогуаниди 1) или производным изотиоциановой кислоты или подвергн та адаптации. Адаптацию проводят путем культив рования родственных видов в культуральной среде, содержащей специфиче кие аминокислоты или аналоги аминокислот, ял и их комбинации,такие амин кислоты, как например,треонин,валин метионин,серин,лизин,или такие анал ги аминокислот, как р, -гидроксинорва лин, .тС -аминомаСляная кислота, «t- -амино- (5-хлормасляная кислота,S-ам ноэтилцистеин,гидроокиси лизина,серина, метионина и валина. В качестве стиг-тулятора роста L-лизина используют поверхностно-акт ное вещество например полиоксиэтил сорбитантриолет ТВИН от 0,01 до 0,5 в расчете яа общее количество культ ральной среды. Полученную культуру разбавляют соответствующим образом, наносят ее на агар Петри и культивиру штамм в течение 3-5 дней, В качеств источников углерода используют н-па фин, органические кислоты, этанол и т . п . Устойчивый к аминокислотам или и аналогам штаглм подвергают далее мутагенной обработке или адаптации с при ененяем д ругих аминокислот, их аналогов или комбинаций для придания устойчивости против них, Штaм.tы являются устойчивыми в ер де к более чем 0,05% L-треонина и L-валина, ,-или более чем 0,05% L-валина. Штаммы являются устойчивыми к ам нокислотам или их аналогам, к комби нации аминокислот или к комбинациям аминокислот и их аналогов. Полученный штамм образует Ь-лизи при аэробной культивации с применением н-парафинов, содержащих от 10 до 20 атомов углерода в линейной цепи, например керосин, газойль и т,п„ Эти источники углерода применяют казэдый в отдельности или в комбинации из двух или более, В качестве источников азота используют органические и неорганические аммонийные соли, такие, как сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония, ацетат аммония, сукцинат аммония, мочевину, аммиак. в качестве неорганических солей используют фосфат калия, натрия, сульфат магния, железа, марганца, цинка, карбонат кальция и т.п. в количестве, обычно применяемом в процессах ферментации. Показатель рН культуральной среды за весь период культивирования подцерживают от 5,5 до 9,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0, путем добавления ионов аммония. Культивирование проводят при температуре .от 25до , предпочтительно от 30 до , в аэробных условиях, например, при перемешивании с аэрацией или путем взбалтывания. По окончании культивирования образовавшиеся клетки извлекают из культуральной среды, например, фильтрованием или центрифугированием, при помощи ионообменных смол. В качестве ионообменных смол используют,.например, амберлит IRC-84, IRC-120, IRC50, Ионообменную смолу затем элюируют водным аммиаком, элюат концентрируют и нейтрализуют концентрированной соляной кислотой. Вьщеленный хлористоводородный лизин высушивают, получая продукт чистотой более 98%. Пример. Взятый петлей платиновой проволоки посевной материал Acinetobacter sp № 38(АТСС 31023) и родственные ему мутантные штаммы Acinetobacter sp №38-15 (АТСС 024), Acinetobacter sp 38-20 (АТСС 31025) и Acinetobacter sp № 38-20 (АТСС 31028) засевают в пробирку, содержащую 10 мл культуральной среды, состава, %: пептон 1, мясной экстракт 1, дрожжевой экстракт 0,5. Среду предварительно стерилизуют в течение 15 мин при . Культивирование производят в течение .24 ч при для получения посевной культуры. Две капли этой культуры вносят в 10 мл среды пробирки и культивируют затем при 33с. 1.Культуралькая среда (контроль) содержит 15 мл этанола, 12 мл 75%ной фосфорной кислоты, 6 г сульфата аммония, а также содержит, мг: 7HjO 200; FeSO4-7HjO 100; CaCI,- 2HgO 100; ZnSOfl. 7H-O . 30; - - -- - 2; CuSO45HjO 0,5; MnSO4-4Н2О 10 г водопроводная вода 1 л. NaOH 2.Среда, содержащая треонин. Контрольная среда плюс 0,5 г/л треонина. 3.Среда, содержащая валин. Контрольная среда плюс 0,5 г/л валина. Среды стерилизуют при 120°С в течение 15 мин перед посевом. Данные роста штасммов в каждой среде приведены в таблице. Результаты таблицы показывают, что после 20 ч культивирования штамм №38-15 устойчив к треонину и валину и штаммы №№38-19 и 38-20 устойчивы к валину. Каждый из четырех штаммов засевают в косую среду, содержащую н-парафины и соли, имеющую следующий состав, %: H-CIJ- С,8-парафины 0,8, сульфат аммония 0,6; KjHPO, 1 MgSO. 7Н;,0 0,02; 1,0; NaCI 0,1; THjO 0,1; 0,003; MnS0.4HjO 0,0003; агар 2 CaClj,. Hj,0 0,01. Культивирование проводят 2 дня при 33°С, рН 7,0, стерилизуют при 120°С в течение 15 мин. Взятую петлей платиновой проволоки эту культуру засевают в 20 мл указанной среды, содержащейся в ко бе Сакагучи на 500 мл и культивируют при 33°С в течение 10 дней. Среда для получения L-лизина имеет следующий состав, %: H-C,i-C,g -парафины 10; K.HPO.0,05; 0,605; MgSO -7HjO 0,05, FeSQ, 7Н-г. 0,001 ZnSO47HiO 0,001, MnSq,- 4Н , ТВИН 85 0,1; СаСО, 3; (NH) 3,5. Стерилизуют при в течение 15 мин. По окончании культивирования со держание хлористоводородного L-лизина определяют микробиологической пробой, получая следующие данные: Применявшийся Количество штамм,лизина, №Г/Л Пример 2. Штамм 38-15 пр варительно культивируют со взбалты нием в среде из н-парафинов и неор нических солей косой культуры, как описано в примере 1, в течение 2 дней при 33 С. Взятую петлей . плати новой проволоки эту культуру засевают в 30 мл указанной среды, содержащейся в колбе Сакагучи, на 500 мл, и затем культивируют со взбсштываи ем при 33°С один день, Среда посевной культуры имеет состав, %: H-Cjj - С(8 -парафин 2; 75%-ная фосфорная кислота 1,2 (по. объему); (NH4J,jSO4 0,6; NaCI 0,1, MgS04- 7HjO 0,02; 0,01. FeS0.7Hj,0 0,01; ZnSOj,- 7HjO 0,003 Мп504-4Нг.О 0,0002; ТВИН 85 0,05; КОН 1,4. Стерилизуют при в течение 15 мин. 5 мл получившейся посевной культуры переводят в 200 мл среды, имеющей такой же состав и содержащейся в колбе Сакагучи на 2 л, и культивирование со взбалтыванием продолжают один день при . Затем 600 мл посевной культуры вносят в 19 л указанной ниже среды для получения L-лизина, содержащейся в ферментере на 30 л, и культивируют при взбалтывании, азрировйнии со скоростью 27 л/мин, перемешивании при 500 об/мин, рН от 5 до 8 поддерживают водным аммиаком в течение 72 ч. Среда для получения L-лизина имеет следующий состав, %: н-С, - С,-парафин 10; KjHPO - 0,05; iO,04; MgSO -7HiO 0,05; FeSO4.7HiO 0,001; 7Hj,O 0,001; MnSQ,. 4HiO 0,001; ТВИН 85 0,1; (NH« ). 60 2; CaCOj 1. Стерилизуют при в течение 15 мин. Количество образовавшегося L-лизина составляет 22 г/л культуральной среды. Затем 2 л этой среды центрифугируют для выделения клеток, отделенную жидкость пропускают через колонку с ионообменной средой Амберлит IRC-84, адсорбируя L-лизин на смоле. Колонку промывают водой и L-лизин элюируют разбавленньии водным агимиаком.. Элюат концентрируют. рН доводят до 5,5 концентрированной соляной кислотой и после сушки получают 37,9 г хлористоводородного L-лизина, имеющего чистоту более 98%. Пример 3. Взятую петлей платиновойпроволоки бульонную косую культуру AcJ-netobacter sp 38-15, которую перёд этим культивируют в течение 2 дней при , используют для посева в 20 мл среды в колбу Сакагучи на 500 мл. Затем штамм культивируют при 33°С 4 дня на среде следующего состава,%: этанол (подаваемый порциями) 5; KjHPO 0,1; KHjPQ,. 0,1; HgSOfln O 0,05 ;.FeSO4-7Hj,O 0,001; ZnSO 0,001; MnSOj,- 4H}0 0,001; ТВИН 85 0,1; CaCO 1; (NH, )j SOa 1. Стерилизуют при 120°C в- течение 15 мин. По окончании культивирования определяют, что культуральная среда содержит 4,1 г L-лизина на 1 л. Пример 4. Штамм Acinetobac- ter sp 38-15 культивируют, как описано в примере 3, но в качестве источника углерода в среде используют вместо этанола уксусную кислоту. Микробиологическая проба показывает, что копичество L-лизина составляет 3,7 г на 1 л культуральной среды. Предлагаемый способ получения L-лизинэ по сравнению с известным обеспечивает повьгшенный выход L-лизина и может быть использован для его прогФииленного получения.

Контрольная

Контрольная+ + треониновая

Контрольная + валиновая

Контрольная + f треониновая

Контрольная -f валиновая

Формула изобретения

i. Способ по п.1,отличаю ц и А с я тем, что штамг-1ы являются устойчивыми в среде к более чем €,а5%

Г,-треонина и L-валина, или более чем 0,05, Ii-валина.

-X. -амино- р -хлормасляная кислота, .1иноэтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокись метионина и гидроокись валина.

I Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент СССР №266649, кл. С 12 D 13/16, опублик, 1970.