РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PUR 291-HAV 22, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С β -ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ Советский патент 1994 года по МПК C12N15/51 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, в частности к получению генно-инженерных вакцин против гепатита А.

Целью изобретения является создание новой рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей экспрессию в клетках E. cjli антигенных детерминант ВГА, способных индуцировать при введении их животным образование антител, связывающих нативный вирус.

Сконструирована рекомбинантная плазмида pUR 291-HAV 22, кодирующая синтез антигенных детерминант вируса гепатита А, которая характеризуется следующими признаками:
состоит из:
Pst-линеаризованной плазмиды pUR 291, которая является производной плазмиды pBR 322 и содержит промотор, оператор и структурный ген полной β-галактозидазы,
последовательности генома вируса гепатита А длиной 389 п.о., кодирующей белок VPI с 4 по 133 аминокислоту и локализованной с 5167 по 5556 п.о. влево от ECoRI-сайта;
содержит:
ген устойчивости к ампициллину в качестве генетического маркера,
участки узнавания уникальными эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях влево от EcoRI - сайта, п.о.: Sal I 5157, Hind III 5560,
участки узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях в п. о. влево от EcoRI сайта, п.о. : BamHI 5152 и 5320, Pst I 5167 и 5556;
имеет длину 5589 п.о.;
обеспечивает синтез антигенных детерминант вируса гепатита А в составе слитого с β-галактозидазой белка.

В качестве экспрессирующего вектора используют плазмиду pUR 291, кодирующую синтез полной β-галактозидазы, содержащей в С-концевой части гена полилинкерную последовательность, которая позволяет встраивать чужеродные фрагменты ДНК таким образом, что плазмида программирует синтез полной галактозидазы, к С-концу которой присоединен белок, кодируемый встроенным фрагментом ДНК.

В качестве такого фрагмента ДНК используют проклонированную ранее нами последовательность ВГА длиной 389 пар нуклеотидов (штамм HAS 15), кодирующую фрагмент белка VPI. Эту последовательность встраивают в Pst-сайт pUR 291, получают плазмиду, кодирующие синтез слитого белка, содержащего полную β-галактозидазу и фрагмент белка VPI с 4 до 133, аминокислоту.

Полученный слитый белок используют для иммунизации животных и определяют образование у них антител, способных связываться с нативным вирусом.

Физическая карта плазмиды pUR 291-HAV 22 приведена на чертеже.

Новая плазмида pUR 291-HAV 22 отличается от известной тем, что обеспечивает синтез продукта, способного вызывать иммунный ответ у животных.

П р и м е р. 5 мкг pUR 291 (ЕМВОj, 1983, 2, р.511-525) расщепляют рестриктазой Pst I в 50 мкл раствора, содержащего 10 мм Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ меркаптоэтанола, 5 е.а. Pst I в течение 1 ч при 37^оС. Аналогично расщепляют pHAV 22. Фрагмент ВГА длиной 389 п.о., кодирующий часть белка VPI, выделяют электрофоретически и лигируют с pUR 291, расщепленной Pst I. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 71-18 и с помощью рестриктного анализа находят плазмиды, содержащие фрагмент генома ВГА в нужной ориентации.

Клон, содержащий требуемую плазмиду, наращивают в 20 мл LB-среды, содержащий 0,02% IPTG, в течение ночи. Клетки центрифугируют и лизируют 2 мин при 100^оС в 400 мкл раствора, содержащего 3% SDS, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 10 мм Трис-HCl (рН 7,0). Лизат разделяют электрофоретически в SDS - содержащем полиакриламидном геле и слитый белок, содержащийся в лизате в количестве более 50% от всех клеточных белков, выделяют электроэлюцией в 0,1% SDS. Выход 2 мг.

Полученный белок тестируют на содержание антигенных детерминант интактного ВГА с антителами к целому вирусу, выделенными из морских свинок после гипериммунизации очищенным препаратом ВГА, размноженным в культуре клеток.

Для этого поливинилхлоридные иммунопанели сенсибилизируют анализируемым белком в течение 16 ч при 20^оС, затем последовательно инкубируют с разведенной 1:100 анти-ВГА сывороткой и меченым ¹²⁵I протеином А.

Из табл.1 видно, что слитый белок содержит антигенные детерминанты нативного ВГА.

Этот белок используют для иммунизации кроликов в виде элюата с полиакриламидного геля. Курс иммунизации 2 недели по 60 мкг на животное.

Сыворотка отбирается от каждого животного и тестируется на способность связываться с интактным ВГА в конкурентной реакции с антителами, выделенными из человека, переболевшего гепатитом А и имеющими высокий титр антител к вирусу.

Результаты анализа приведены в табл.2. Из табл.2 видно, что сыворотка одного из кроликов содержит антитела, способ- ные связываться с нативным вирусом после его иммунизации слитым белком, содержащим фрагмент белка VPI с 4 по 133 аминокислоту и полную β-галактозидазу.

Таким образом, новая рекомбинантная плазмида pUR 291 обеспечивает экспрессию в клетках E.coli антигенных детерминант вируса гепатита А, способных индуцировать при введении их животным образование антител, связывающих нативный вирус.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии, в частности к получению генноинженерных вакцин против гепатита А. Целью изобретения является создание новой рекомбинантной плазмиды, обеспечивающий экспрессию в клетках E.coli антигенных детерминант вируса гепатита А, способных индуцировать при введении их животным образование антител, связывающих нативный вирус. Новая рекомбинантная плазмида pUR 291-HAV 22 состоит из Pst-линеаризованной плазмиды pUR 291, последовательности генома вируса гепатита А (размером 389 п.о.), кодирующей белок VP1. 2 табл. 1 ил.

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PUR 291-HAV 22, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С β -ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ, имеющая длину 5589 п.о. и содержащая: Pst - линеаризованную плазмиду pUR 291 с промотором, оператором и структурным геном полной β -галактозидазы; последовательность генома вируса гепатита А длиной 389 п.о., кодирующую белок VPI с 4 по 133 аминокислоту и локализованную с 5167 по 5556 п.о. влево от EcoRI-сайта, ген устойчивости к ампицилину в качестве генетического маркера, участки узнавания уникальными эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях влево от EcoRI-сайта, п.о.: Sal I 5157, Hind III 5560, участки узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях влево от EcoRI - сайта, п.о.: BamHI 5152 и 5320, PstI 5167 и 5556.