Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 A61K39/29 

терферон человекав слитый с белками ВГЛ, в бактериапьФт клетках, или плаамиду pSPUU, встраиваемую в вектор оеповакцняы ЛИВП,- обеспечивающую синтез полипептидов я живоп к клетках,

iviK плазмиду pSPUU, встраиваемую и вирус осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в ораганизмах животных.

Изобретеиие относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано дщя получения генно-инженерной вакцины против гепатита А.

I Целью изобретения является получе- ; ние погшпептидных субстанций, способных вызывать образование антител при введе ЕИИ их в организм животных.

В качестве генома вируса гепатита А (ВГА) используют фрагмент длиной I 4296 п.о., содержащий I фрагмент длиной 3372 и.о., коди- , 1 уюп1ий все структурные. и некоторые

неструктурные белки ВГА, И; фрагмент длиной 924 п.о., коди- . рузрщий вирусную протеазу, способную расщеплять синтезируемый вирусным

ts

20

25

30

геномом непрерывный полипептид на Отдельные белки,

или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА;

или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий подипептидную цепь, содержащую фрагменты белков UP3 со ПО по 233 а.к. и UP1 с 1 по 271 а.к.;

или фрагмент длиной 389 ПоО,, кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 129 а.к.;

или фрагмент.длиной 144 п .о., кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 57 а.к.;

или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка UP1 с II по 25 а.к., имеющий следующую структуру:AATTCACAGTTAGTACTGAACAAAATGTACCAGATCCACAGGTAGGTATTGCG

GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCCATAACGCCTAG,

слитые с у5-галактозидазой фрагмен- ты белков ВГА или плазмиды pIFN-ful и pIFN-fu2, состоящие из большего Е. coRI-Pstl фрагмента плазмиды pBR 322, гена зрелого 1-интерферона человека, находящегося под контролем trp-npoMOTopa Е. coli, в котором терминирующий кодон убран с помощью эндонуклеазы рестрикации Hinf1 и заменен синтетическими фрагментами ДНК, имеющими следующую структуру:

а в -качестве экспрессирующих векторов используют любой экспрессирую- щий вектор,обеспечивающий синтез требуемых вирусных белков в бактериальных или животных клетках, в частности плазмиды pUR 291 и pUR 292, которые обеспечивают синтез полипептидных субстанций в бактериальных клетках, например, в штаммах Ё. coli К12. ГСолипептид- ные субстанции представляют собой

40

AS

AGT GAG ATG GTG ТТТ CAA GGT GGA AGA GCA TCC GAG ACT GGA GTC TAG GAG AAA GTT CGA GGT TGT GGT AGG GTC TG

AGT GAG ATG GTG TTT GAA GGT GGA AGA GGA TGG GAA GAT GTG GA GTG TAG GAG AAA GTT GGA GGT TGT GGT AGG GTT СТА G

Пример)о 5 мкг плазмиды pUR 291 расщепляют в стандартных ус- ловиях эндонуклеазой рестрикции Pstl. Реакционная смесь содержит 10 ьй1 трис-НС1, 10 MM.MgCl, 10 viM. 2-меркаптозтанола,5 мкг плазмидной ДНК и 5 е.а. фермента. Инкубацию осуществляют при 37°G в течеиие 1ч.

геномом непрерывный полипептид на Отдельные белки,

или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА;

или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий подипептидную цепь, содержащую фрагменты белков UP3 со ПО по 233 а.к. и UP1 с 1 по 271 а.к.;

или фрагмент длиной 389 ПоО,, кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 129 а.к.;

или фрагмент.длиной 144 п .о., кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 57 а.к.;

или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка UP1 с II по 25 а.к., имеющий следующую структуру:GATCCACAGGTAGGTATTGCG

Требуемый фрагмент элюируют феноль- ной экстракцией после электрофореза в низкоплавкой агарозе. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фраг- ментом длиной 389 п.о., вьщеленным из плазмиды pHAU22. Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. coli ВМН 71-18.

Клоны, содержащие плазмиды с нуж- ой ориентацией фрагмента, наращива- , т в ЪБ-среде с ампициллином и IPTG, интезируемый гибридный белок, со- ; ержаЕ ий полную /5-гапактозидазу фрагмент 5елка UP1 ВГА (с 4 по 129.а.к.), выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестирзтот на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами .

В результате иммунизации у одной из трех морских свинок и у одного из трех кроликов в сыворотке были обнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА.

Пример2. 5 мкг плазмиды pUR 292 расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции Pstl. Реакционная смесь содержит 10 мМ трис-HCl, 0 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмидной ДКК и 5 е.а. фермента. Инкубацию осуществляют при 37°С в течение 1 ч. Требуемый фрагмент элюируют феноль- ной экстракцией после электрофореза в низкоплавкой агарозе. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фрагментом длиной 3372 По о., выделенным из плазмиды pHAU23 (ДАН СССР, 1985, т. 285, 1014) в реакционной смеси, содержащей 0,1 мкг векторной ДНК, 0,1 мкг ДНК-вставки в вьшшприведенном буфере в присутствии гАТР (0,1 мМ). Лигаз- ной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. coli ВИН 71-18 в клонах, содержащих плазмиду со ; встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эн- донуклеазы рестрикции BamHl.

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в LB-среде с ампициллином и IPTG, синтезируемый гибридный белок, содержащий полную д-галактозидазу, все структурные (начиная с 38 а.к. балка UP4) и часть неструктурных белков ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворот- ку морских свинок тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

В результате иммунизации у одной из четырех свинок в сыворотке были обнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА,

ПримерЗоЗ мкг плазмиды pIFN-ful расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазной рес рикции Pstl, как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с Pstl

фрагментом длиной 389 п.о., выделенным из плазмиды pHAU22. Лигазной смесью трансформируют компетентные кпетки штамма Е. coli НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bgl11 и ВашН.

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в среде М-9 с тетрациклином и бе- та-индолилакрШ1овой кислотой. Синтезируемый гибридный .6 ело к, со держащий полный гамма-интерферон человека и фрагмент белка UP1 ВГА (с 4 по

129 а.к.), выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации - морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку

морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

Многие из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела, способные связываться с нативным вирусом.

Пример4. 5 мкг плазмиды

pIFN-ful pHAU22 расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции Bgl11 и затем Pstl, как описано в примере 1. Полученный больший фрагмент лигируют с Bgl II - (/iPuuII)Pstl

фрагментом длиной 1243 п.о., выделенным из плазмиды pHAU23. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. .coli НВ 101 ив клонах, содержащих плазкиду со встроенным фрагментом, .определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Baml.

Кпоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают

в среде М-9 с; тетрациклином и л-индЬ- липакриловой кислотой, синтезируемый гибридный белок, содержащий полный Т интерферон человека и фрагменты е)ел-, ков UP3 (со 110 по 23 а.к.) и UP1 (с 1 по 271 а.к.) ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

20

25

30

Через несколько недель после за- вершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурент- 15 ной реакции с человеческими антителами. .

Большинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали анти- тела .в достаточно высоких концентрг циях, способные связываться с нативным вирусом.

Пример5.5 мкг плазмиды p(FN-fu2 расщепляют в стандартных условиях зндонуклеазной рестрикции Pstl, как описано в примере 1. Полу- ченньй фрагмент лигируют с Pstl фрагментов длиной 3372 п.о.,, вьзделенным из плазмиды pHAU23. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli НВ 10.1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bglll и EcoRl.

Клоны, содержаш 1е плазмиды (piFN- fu2-pHAU23) с фрагментом в нужной ориентации, наращивают в среде М-9 с тетрациклином и -индолилакрило- вой кислотой, Синтезируемьй гибрид- - ный белок, содержащий полный «-интер- ферон человека и все структурные (начиная с 38 а. к о ЦРА) и часть неструк--. турных белков ВГА, выделяют из бактериальных клеток, используют для . иммунизации морских свинок и кроликов.

Через йесколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на соде | жа1ше антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими ;ан- ителами.

Большинство им1«унизированШ)1х морских свинок и кроликов содержали анти- тела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с натив-/ ным вирусом.

10

50

40

,

0

5

0

5

.

Примерб, 5 мкг плазмиды i pTFN-ful расщепляют в стандартных условиях зндонуклеазой рестрикции Pstl, как описано в примере 1. Полу- ченньй фрагмент лигируют с Pstl- BamHl фрагментом длиной 144 п.о., кодирующим фрагмент блока UP 1 с 4 по 57 а.к,, выделенным из плазмиды 0 PHAU22, и синтетическим адаптором, имеющий следующую структуру:

GAT ССА GTT ТАА CTG СА СТ САА АТТ G

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoR) и Baml,

Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, нарагцива- ют в среде М-9 с- тетрациклином и . д- индолилакриловой кислотбй. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный 1 -интерферон человека и фрагмент UP1 белка ВГА (с 4 по 57 а,к.) выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связьтаться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

Большинство иммунизированных- морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентра- циях, способные связываться с нативным вирусом, ,

Приме, р 7, 5 мкг плазмиды ptFN-ful расщепляют в стандартных условиях зндонуклеазой рестрикции Pstl, как описано в примере К Полученный фрагмент лигируют с синтети ческим фрагментом ДНК, кодирующим 0 фрагмент белка UP1 с 11 по 25 а,к.

и адапторным фрагментом, имеющим следующую структуру:

0

G GGT ТСС G АС GTC ест AGG СТТ АА

Клоны, содержащие фрагменты в нужной ориентации, наращивают в

среде М-9 с тетрациклином и й-индо- лилакриловой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный Y -интерферон человека и фрагмент бел- ка UP1 ВГА с 11 по 25 а.к., выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов

Через несколько недель после за- вершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими ан- тителами.

Некоторые из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с нативным вирусом.

Примере, 5 мкг плазмиды pSPUU расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции BamHl, как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фрагментом длиной 3372 По о., вьщеленным из плазмиды pHAU23, с синтетическим фрагментом ДНК следующей структуры:

GATCCT АТС AGG ACT GCA . СА TAG ТСС tC

Лпгазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. coli ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего.

Б ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определяют структуру сочленения методом Макса ма-Гилберта.

ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содер жащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка UP/O .и некоторые неструктурные белки ВГА, используют дпя трансформации клеток почек зеленой мартьшки линии CUl, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на эмбриональные фибро- бласты крысы перевиваемой линии RAT2 tk-фенотипа. В присутствии бром дез оксиуридина клонируют рекомби- . нантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последовательности ВГА (ЛИВП-рЗР-Ш-НАи-П),

0

5

наращивают на клетках RAT2 .на среде Dulbecco 8 MEM с 5% сыворотки новорожденных телят. Синтезируемый .белок ВГА в виде клеточных лизатов используют дпя иммунизации морских свинок и кроликовс

Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкуг рентной реакции с человеческими антителами.

Большинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные Лязьшаться с нативным вирусом.

Пример9. 5 мкг плазмиды pSP-UU-HAU-D, содержащей фрагмент генома ВГА длиной 3372 п.о., расщепляют частично Pstl, как описано в примере 1, Полученную линейную форму плазмиды лигируют с Pstl фрагментом 924 п.о., вьзделенным из плазмиды pHAU5-prot кодирующим вирусную про- теазу.

Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. coli ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонукпе- аз рестрикции Вага Н(, Puuf , Hind III.

В ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определяют структуру сочленений методом Максама-Гилб ерта.

(

ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D-protea с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содержащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка UP4) и некоторые неструктурные белки ВГА, используют дпя трансформации клеток почек зеленой мартьшки линии GUI, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на змбриональные фиб- робласты крысы перевиваемой линии RAT2 tk-фенотипа, В присутствии бромдезоксиуридина клонируют реком- бинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последовательности ВГА, (miBn-pSP-UU-HAU-D- protea), наращивают на клетках RAT2 на среде Dulbecco s MEM с 5% сыворотки новорожденных телят. Сиитезируемый белок ВГА г виде клеточ- ных лиэатов используют для иммунизации морских свинок и кроликов.

Через несколько недель после за- вершения курса иммунизации сыворотку морских свинок н кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.

Болыпинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с натив ным вирусом.

П р и м е р 10. Все операции проделывают, как в примере 8,, но вместо иммунизации кроликов клеточным лизатом осзщеетвляют их вакцинацию очищенным рекомбинантньп вирусом осповакцины с титром частиц/мл

На боку кролика выбривают поверхность 5 ct/ и скарифицируют. На зту поверхность наносят 0,1-0,2 мл вируса. На 3-А день возникает специфическая воспалительная реакция. К 20 дню поверхность кожи очищается. Че-( рез 3-4 недели после заражения отбирают сыворотку. Ее титр против осповакцины составляет 1:640, 1:1280.

Сьшоротка также содержит антитела против ВГА.

Таким образом, изобретение позволяет получать генно-инженерные продукты, которые могут быть использованы как субстанции, потенциально пригодные для приготовления генно- инженерных вакцин, поскольку они вызывают образование у животных антител, связывающих вирус гепатита А.