РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PUR 292 - HAV 23, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С β -ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ Советский патент 1994 года по МПК C12N15/51 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано для разработки подходов к получению генноинженерной вакцины против вируса гепатита А.

Целью изобретения является создание новой рекомбинантной плазмиды, обеспечивающей экспрессию в клетках E. coli антигенных детерминант ВГА, способных индуцировать при введении их животных образование антител, связывающих нативный вирус.

Сконструирована рекомбинантная плазмида pUR 292-HAV 23, кодирующая синтез антигенных детерминант вируса гепатита А, которая состоит из:
Pst-линеаризованной плазмиды pUR 292, которая является производной плазмиды pBR 322 и содержит промотор, оператор и структурный ген полной β-галактозидазы,
последовательности генома вируса гепатита А длиной 3372 п.о., кодирующей непрерывный полипептид, содержащий часть белка (с 38 а.к.), белки VP2, VP3, VP1 и некоторые неструктурные белки (по 1167 а.к.);
содержит:
ген устойчивости к ампициллину в качестве генетического маркера,
участок узнавания уникальной эндонуклеазой рестрикции XbaI, расположенный на расстоянии 8268 п.о. влево от EcoRI-сайта,
участки узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях в п.о. влево от EcoRI-сайта; BamHI 5152 и 6679, Pst I 5167 и 8539, Hind III 6392 и 8543.

имеет длину 8572 п.о.,
обеспечивает синтез антигенных детерминант вируса гепатита А в виде слитого с β-галактозидазой полипептида.

Плазмида pUR 292, используемая в качестве экспрессирующего вектора, содержит в С-концевой части гена полилинкерную последовательность, которая позволяет встраивать чужеродные фрагменты ДНК таким образом, что плазмида программирует синтез полной β-галактозидазы, к С-концу которой присоединен белок, кодируемый устроенным фрагментом ДНК.

В качестве чужеродного фрагмента ДНК используют проклонированную ранее последовательность ВГА штамма HAS-15 длиной 3372 пар нуклеотидов, кодирующую белки VP4, VP2, VP3, VP1 и неструктурные белки ВГА. Эту последовательность встраивают в Pst-сайт pUR 292 и получают плазмиду, обеспечивающую синтез указанных белков в виде слитого с β-галактозидазой белка.

Полученный слитый белок используют для иммунизации животных и определяют образование у них антител, способных связываться с нативным вирусом. Физическая карта плазмиды pUR 292-HAV 23 приведена на чертеже.

Новая плазмида pUR 292-HAV 23 отличается от плазмиды, описанной в прототипе, тем, что для ее конструирования использован другой экспрессирующий вектор и иной фрагмент ВГА, полученный на основе штамма HAS-15, существенно отличающегося от штамма CR-326, используемого в прототипе.

Кроме того, новая плазмида обеспечивает синтез продукта, способного вызывать иммунный ответ у животных.

П р и м е р. 5 мкг pUR 292 (EmBOJ, 1983, 2, р. 511-525) расщепляют рестриктазой Pst I в 50 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MoCl, 10 мМ β-меркаптоэтанола, 5 е.а. Pst I, в течение 1 ч при 37^оС. Аналогично расщепляют pHAV 22 (ДАН СССР, 1985, 285, 1014-1018). Фрагмент ВГА длиной 3372 п.о., кодирующий белки VP4, VP2, VP3, VP1 и некоторые неструктурные белки, выделяют электрофоретически и лигируют с pUR 292, расщепленной Pst I. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 71-18 и с помощью рестриктного анализа находят плазмиды, содержащие фрагмент генома ВГА в нужной ориентации.

Клон, содержащий требуемую плазмиду, наращивают в 20 мл LB-среды, содержащей 0,02% IPTG, в течение ночи. Клетки центрифугируют и лизируют 2 мин при 100^оС в 400 мкл раствора, содержащего 3% SDS, 5% 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 20 мМ трис-HCl (рН 7,0). Лизат разделяют электрофоретически в SDS-содержащем полиакриламидном геле и сплавленный белок, содержащийся в лизате в количестве не более 1% от всех клеточных белков, вырезают из геля в виде полоски, которую промывают изопропанолом и буфером, измельчают и используют для иммунизации морских свинок. В каждой группе по четыре морских свинки.

Сыворотку отбирают от каждой морской свинки и тестируют на способность связываться с интактным ВГА в конкурентной реакции с антителами, выделенными из человека, переболевшего гепатитом А и имеющим высокий титр антител к вирусу.

Результаты анализа приведены в таблице (для одной из групп морских свинок).

Из таблицы видно, что сыворотка одной из морских свинок содержит антитела, способные связываться с интактным вирусом, причем титр антител возрастает по мере иммунизации.

Таким образом, новая рекомбинантная плазмида PUR 292-HAV 23 обеспечивает экспрессию в клетках E.coli антигенных детерминант вируса гепатита А, способных индуцировать при введении их животным образование антител, связывающих нативный вирус.

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано для разработки подходов к получению генноинженерной вакцины против вируса гепатита А. Целью изобретения является создание новой рекомбинантной плазмы, обеспечивающей экспрессию в клетках E.coli антигенных детерминант ВГА, способных индуцировать при введении их животным образование антител, связывающих нативный вирус. Новая рекомбинантная плазмида pUR 292 - HAV 23 состоит из Pst-линеаризованной плазмиды pUR 292, которая является производной плазмиды pBP 322 и содержит промотор, оператор и структурный ген полной b - галактозидазы, и последовательности генома ВГА длиной 3372 п.о., кодирующей непрерывный полипептид, который содержит часть белка VP 4 (с 38 а. к.), белки VP 2, VP 3, VP 1 и некоторые неструктурные белки (по 1167 а.к. ). 1 ил., 1 табл.

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PUR 292 - HAV 23, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С β -ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ, имеющая длину 8572 п.о. и содержащая Pst-линеаризованную плазмиду pUR 292, с промотором, оператором и структурным геном полной β-галактозидазы; последовательность генома вируса гепатита А длиной 3372 п. о. , кодирующую синтез непрерывного полипептида с частью белка VP4 (с 38 аминокислоты), белков VP2, VP3, VP1 и некоторых неструктурных белков (по 11-67 аминокислоту), ген устойчивости к ампицилину в качестве генетического маркера, участок узнавания уникальной эндонуклеазой рестрикции XbaI, расположенный на расстоянии 8268 п.о. влево от EcoRI-сайта, участки узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях влево от EcoRI-сайта, п.о.: BamHI 5152 и 6679, Pst I 5167 и 8539, Hind III 6392 и 8543.