Рекомбинантная плазмидная ДНК @ 10FMD, кодирующая гибридный белок Р204-AS @ Р @ С @ С @ - VPI/200-213/ Р @ Р @ S @ Р @ ( 131-160) и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI -продуцент гибридного белка Р204- А @ Р @ С @ С @ V PI/200-213/-Р @ Р @ S @ Р @ - VPI /131-160/ Советский патент 1992 года по МПК C12N15/42 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага

Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. col - продуцент этого полипептида.

Вирус ящура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохозяйственных животных, наносящее значительный ущерб. В качестве вакцины против ящура используют инактивирован- ный вирус. Технология приготовления такой вакцины требует опасного крупномасштабного культивирования вирулентного вируса. Недостатком ее применения являются вспышки заболевания, вызванные не полностью инактивированным вирусом.

Вирус ящура представляет собой нукле- опротеид, состоящий из одной молекулы од- ноцепочечной значащей РНК и 60 копий каждого из капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Поверхностный белок VP1 является главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вирус- ней рализующих антител.

Однако полученный в чистом виде из вирусной частицы или технологией реком- бинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ, и поэтому не может использоваться в качестве субьединичной вакцины.

Альтернативный подход к созданию субьединичных вакцин против ящура вытекает из наблюдения, что синтетические пептиды, .включающие аминокислотные последовательности 141-160 и 200-213 белка VP1, при иммунизации в виде конъюгатов с белком-носителем вызывают образование значительного уровня вируснейтрализующих антител.

Однако и в этом случае иммуногенность наиболее активного из этих пептидов остается в 100-1000 раз ниже, чем иммуногенность целого вируса.

Трудности в создании субьединичной вакцины можно преодолеть, используя для синтеза иммуногенного пептида технологию рекомбинантных ДНК.

Известна рекомбинантная плазмида pFMD65, кодирующая гибридный белок, в котором аминокислотная последовательность /J-галактозидазы Е. coll соединена с повторяющейся последовательностью 141- 160 белка VP1 вируса ящура (штамм OiK). Методами иммунодиффузии и иммунофер- ментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду

pFMD65, специфически связывается с антителами к целому вирусу ящура OiK и к фрагменту 136-148 капсидного белка VP1.

Известны рекомбинантные плазмиды рМ01-71, рМ01-72, рМ01-74 и рМ01-78, кодирующие гибридные белки, в которых еди- ничнаяилиповторяющиеся

последовательности 137-162 поверхностного белка VP1 вируса ящура (штамм 01, BFS) слиты с последовательностью /3 -галактозидазы Е. col). Кодируемые этими плазми- дами гибридные белки способны при иммунизации морских свинок вызывать появление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте

и иммуноблоттинге с рекомбинантным антигеном.

Однако данные о способности получаемых антител нейтрализовать вирус и предотвратить инфекцию отсутствуют.

По принципу конструирования рекомбинантная плазмида pFMD65, кодирующая гибрид /3-галактозидаза - антигенная детерминанта вируса ящура OiK, является наиболее близким к предлагаемому

решением. ,

Недостатком перечисленных плазмид- ных конструкций является то, что все они кодируют гибридные белки, в которых пептиды антигенных детерминант соединены с

/3-галактозидазой Е. coll. Однако сама бактериальная Д-галактозидаза является достаточно сильным иммуногеном. Кроге того, доля пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала, чтобы вносить

существенный вклад в иммунный ответ.

Цель изобретения - конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК plOFMD, кодирующей биосинтез иммуногенного полипептида Р204, которые инициируют образование нейтрализующих антител против штамма А22 вируса ящура, и бактериального штамма Е. coli SG20050/p10FMD (ВКПМ В- 5297) - продуцента этого полипептида, обеспечивающего высокий уровень его биосинтеза.

Кодируемый плазмидой plOFMD имму- ногенный полипептид состоит из аминокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной

своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 200-213 аминокислот белка VP1). которая посредством пептидного спейсера ProProSerPro.

обеспечивающего изгиб полипептидной цепи, соединена с последовательностью главной вариабельной антигенной детерминанты вируса ящура (последовательность 131-160 белка VP1). Выбор этой последовательности обусловлен данными по локализации главного иммуногенного эпитопа вируса ящура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух «-спиралей антигенных детерминант. В структуре иммуногенных полипептидов последовательность фактора некроза опухолей человека соединена с последовательностью пептидных антигенных детерминант вируса ящура через дипептид AspPro, что обеспечивает в случае необходимости возможность отщепления иммуно- генных пептидов в условиях мягкого кислотного гидролиза.

Рекомбинантная плазмидная ДНК plOFMD, кодирующая иммуногенный полипептид Р204, характеризуется следующими признаками: кодирует аминокислотную последовательность гибридного белка - фактор некроза опухолей человека - AspProCysCys-VP1(200-213)-ProProSerPro -VP1(131-160); имеет мол.м. 2,49 Мд (3,81 т.п.о.); состоит изSauSAI/Hindlll -фрагмента ДНК плазмиды pTNF3l4A, содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансляции, терминатор транскрипции фага лямбда и ген / -лзктамазы(3,66т.п.о.). SauSAI/Hlndlll - фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса ящура (штамм А22); а также содержит в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой plOFMD клеток Е. coli к пеницил- линовым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеаза- ми, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта BstEII: BamHI - 73 нуклеотида, Bglfl - 154 нуклеотида, Xhol - 174 нуклеотида, Hindlll - 241 нуклеотида, Ncol-574 нуклеотида, Pstl -2418 нуклеоти- дов.

На схеме изображены лигазные сшивки синтетических олигонуклеотидов в двухце- почечные ДНК (сегменты А и В), кодирующие пептиды - антигенные детерминанты белка оболочки VP1 вируса ящура (подтип

А22).

Для получения двухцепочечных ДНК, кодирующих антигенные детерминанты вируса ящура (сегменты А и В) амидофосфит- ным способом синтезируют двенадцать олигонуклеотидов величиной от 14 до 43 нуклеотидных звеньев, которые затем соединяют при помощи ДНК-лигазы.

Для дальнейшего конструирования используют рекомбинантную плазмиду pTNF314 Л, которая является производной плазмиды pTNF31lAc измененной с по- 5 мощью олигонуклеотид-направпенного мутагенеза С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека. В рез-ультате в самый С-конец гена был введен уникальный для этой плазмиды рестрикт- 0 ный сайт Bglll. ДНК плазмиды pTNF314A расщепляют эндонуклеэзами ВоДИ и Hindlll, больший фрагмент выделяют и лйгируют с избытком нефосфорилированного сегмента А. Аликвоту реакционной смеси используют

5 для трансформации компетентных клеток Е. coli HB101. Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и скрининг колоний проводят гибридизацией с 5 - Р -меченным оли0 гонуклеотидом VIII. Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК p8FMD, строение которой подтверждают рестрикт- ным анализом с помощью эндонуклеаз Haell и Mspl, а также определением нукле5 отидной последовательности части плаз- мидной ДНК между сайтами рестриктаз Hindlll и BamHI.

Для конструирования новой рекомби- нантной плазмиды plOFMD плазмидную

0 ДНК pSFMD сначала линеаризуют гидролизом эндонуклеазы Pstl, а затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Kpnl. Из образовавшейся смеси фрагмент величиной

5 около 2,2 т.п.о. выделяют электрофорезом в 1% геле легкоплавкой агарозы. С другой стороны ДНК плазмиды рТ1МР314Дгидроли- зуют смесью рестриктаз BgUI и Pstl. Выделенный электрофорезом как описано

0 Pstl/Bglll - фрагмент величиной около 1,6 т.п.о. лйгируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента В с Pstl/Kpnl - фрагментом ДНК плазмиды pSFMD величиной около 2,2 т.п.о. Частью

5 лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. coti HB101: трансформанты высевают на 1,7%-ный LB-arap, соде.ржа- щий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг проводят путем In situ гибридизации колоний с

0 5 - 32Р -меченным олигонуклеотидом XIII.

Выделенную из гибридизующихся колоний

ДНК плазмиды plOFMD, анализируют при

помощи рестриктаз Mspl и НаеШ и ее струк.туру подтверждают определением нуклео5 тидной последовательности в районе клонирования сегмента В.

Рекомбинантная плазмида plOFMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, который представляет собой белок фактора

некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательностью антигенной детерминанты подтипа А22 вируса ящура.

Для получения бактериального штамма - продуцента иммуногенного полипептида Р204 плазмидой plOFMD трансформируют компетентные клетки Е. coli SG20050.

Полученные таким образом штаммы Е. coif 5С20050/р10РМО(ВКПМ В-5297)харак- теризуются следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки.

Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокис- лот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки проявляют устойчивость к ампи- циллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 30 мкг/мл), благодаря наличию транспо- зона.

Штамм Е. coli SG20050/p10FMD обус- лавливает конститутивный синтез больших количеств (свыше 25% тотального клеточного белка бактерий) иммуногенного полипептида Р204, способного при иммунизации животных вызывать образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса ящура.

П р и м е р 1. Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от З -конца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5- диметокситритил-М-эцил-2-дезоксинуклеозид-3 -0-(метоксидиизолропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через З -сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют описанный синтетический цикл, но после реакции конденсации проводят промывку смолы смесью тетрагидрофуран-пиридин-вода (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы удаляют последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя. 5 -Диметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой, и олигонук- леотид очищают электрофорезом в 20%- ном ПААГ, содержащем 7М мочевину. Выход 1-5 о.е.

Лигазную сшивку проводят следующим образом. Смесь 250 пмоль каждого из не- фосфорилированных олигонуклеотидов (I) и (X) и 200 пмоль каждого из фосфорилирован- ных олигонуклеотидов (II)-(V), (VIII) и (IX) нагревают 10 мин при 90°С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 10 мМ MgCf2, затем медленно охлаждают до 15°С, прибавляют гАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 5 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем депротеинизируют двукратной фенольной экстракцией фенолом. ДНК высаживают этанолом, продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 15%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Нужный полинуклеотид выделяют из геля злектроэлюцией на DEAE-бумагу DE-81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфе- ром (10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ ЕОТА) и этанолом. Нуклеотидный материал элюи- руют при помощи 1,5 М раствора NaCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с се- фадексом G-50. Выход сегмента А 180 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход 160 пмоль.

П р и м е р 2. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК p8FMD.

Клетки бактерий Е. coll HB101, содержащие плазмидную ДНК pTNF314A, выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с обычной процедурой с модификациями, заключающимися в том, что к еупернатанту, полученному после подкисле- ния ацетатом натрия, прибавляют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37°С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕ- буфере, содержащем 1 М NlaCI, прибавляют полиэтилен гликоль PEG-6000 до концентрации 1,5%. выдерживают 1 ч при 0°С, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, а осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК определяют спектрофото- метрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о.е. / мг.

Раствор 2 мкг плазмиды pTNF314A в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 7 мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью ре- стриктаз Hindlll и В gill (по 10 ед. каждой) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и векторный фрагмент очищают электрофоре- зом в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы, ДНК выделяют методом замораживания/оттаивания и высаживают 70%-ным этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCIa, 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, прибавляют 0,1 мкг сегмента А и 20 ед, Т4 ДНК- лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем аликвоту (1 /4) реакционной смеси ис- пользуют для трансформации компетентных Е. coli. Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки Е. coli HB101 высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вно- сят в 50 мл .питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), про- мывают раствором 10 мМ MgCte, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaClz и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCl2, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0°С. затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего прибавляют 2 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоты высевают на чашки с LB- агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целе- вую плазмиду p8FMD, идентифицируют гибридизацией с одним из олигонуклеотидов P-VIII, входящих в состав клонируемого сегмента А. Из гибридизующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестрикт- ным анализом с помощью рестриктаз НаеН и Mspl, Окончательно структуру рекомби- нантной плазмиды pSFMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической ДНК,

Пример 3. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК plOFMD.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pSFMD в 80 мкл буфера R прибавляют 20 ед, каждой из рестрикционных нуклеаз Pstl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Kpnl /Pstl - фрагмента (2.2 т.п.о.) проводят при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК пяазмиды pTNF314A в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз В gill и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1,6 т.п.о., содержащий синтетический ген антигенной детерминанты, выделяют при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы, как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют в присутствии 0,3 мкг сегмента В с векторной ДН К (1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15°С. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli НВ101, Трансформанты высевают на агари- зованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду plOFMD, проводят гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонукле- отидом (XIV). Из клонов, гибридизующихся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДНК plOFMD, строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.

П р и м е р 4. Получение штамма - продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса ящура.

Плазмидой plOFMD трансформируют компетентные клетки Е. coli SG20050 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм Е. coli ВКПМ В-5297 - продуцент иммуногенного полйпептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса ящура.

П р и м е р 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида Р204 (биологические испытания).

Для иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма - продуцента рекомбинантный белок Р204 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адъювантом Фрейнда. Группе морских свинок или кроликов массой соответственно 0.5 или 2,0 кг вводят вакцинирующий раствор однократно или двукратно в объеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг. Вторую иммунизацию проводят через 38-42 дня после первой. Вируснейтрализующие антите- ла определяют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре клеток свиной почки против 100 ТЦДбо вируса ящура подтипа А22.

На 47-55 день после первой иммуниза- ции морских свинок заражают введением 500 ИДго вируса ящура Ааг, адаптированного к организму морских свинок, и определяют протективный эффект.

Данные титрования вируснейтрализую- щих антител и протективный эффект, исследованные на кроликах и морских свинках, приведены в табл. 1 и 2 соответственно.

Таким образом, рекомбинантный белок Р204, выделенный из биомассы штамма - продуцента ВКПМ В-5296, обладает защитным действием против вируса ящура подти- па А22 и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок.

Формул а изо бретени я

, Рекомбинантная плазмидная ДНК plOFMD, кодирующая гибридный белок

P204-ASpProCysСуs-VP 1(200-213) ProProSerPro(131-160), мол.м. 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержащая Sau3A1- Hindlll - фрагмент ДНК-плаэмиды pTNF314A с тандемом промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и искусственным участком инициации трансляции, терминатором транскрипции фага лямбда и геном /3-лакта- мазы размером 3,66 т.п.о.; Hindlll-Sau3A1 - фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды антигенных детерминант вируса ящура штамм А22. генетический маркер - ген /3-лактамаэы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта BstElhBamHI - 73 нуклеотида, Bgll) - 154 нуклеотида, Xhol - 174 нуклеотида. HlndlJI - 241 нуклеотид, Nco1 - 574 нуклеотида, Pst1 - 2418 нуклеотидов.

2. Штамм бактерий Escherlchia coli В КПМВ-5297- продуцент гибридного белка P204-AspProCysCys-VP1 (200-213) ProProSerPro-VP1 (131-160).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии; и представляет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого входят антигенные детерминанты вируса ящура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coli - продуцент этого полипептида. Рекомбинантная плазмидная ДНК plOFMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, в котором аминокислотная последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с аминокислотной последовательностью AspProCysCys-VP1(200-

Таблица 1

Таблица 2

bspVroAsnGlyTlirGlyLysTyrSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAsp

1 n ZI1 n iv

GATCCTAACGGTACCGGTAMTACTCTGCTGGTGGTATGGGCCGTAGAGGAGAT- GATTGGCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTCTAiiU

I uGluProLeuAlaAloArgValAlaAlaGlnLeij oThrTER

n -VI11 n IX

CTAGAACCTCTGGCTGCTCGAGTTGCTGCTCAGCTTCCGACTTA GATCTTGGAGACCGACGAGCTCAACGACGAGTCGAAGGCTGAATTCGA

x СЕГМЕНТ А

bspProCysCy islysGlnLysI I ell e AI aProAlaLya

n

GATCCTTGTTGTAGACAGAAACAGAAAATCATTGCACCTGCAAAA- GAAGAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTTTTxiiU

GlnLeuLeuProProSerProAsnGlyThr

XIII

CAACTTTTGCCTCCTTCTC.CTAACGGTAC GTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC

vix СЕГМЕНТ В