Рекомбинантная плазмидная ДНК р28СМЕ, кодирующая синтез полипептидов для получения живой рекомбинантной вакцины против клещевого энцефалита, и способ ее конструирования Советский патент 1993 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, конкретно к получению живой рекомбинант- ной вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса ословакцины.

Целью ичобретенин является создание рекомбинатной п.пячмидной ДНК,

содержащей комплекс СТРУКТУРНЫХ ге- нов ВКЭ и обеспечивающих синтез антигенных полипептидов ВКЭ в клетках млеконитаюпшх.

Поставленная цель достигается конструированием рекомбинпнтной плазмид- ной ДНР р28СМЕ, К( дчрумпц й CHHTO I

структурных белкон ;у1я получения живой вакцины против клещевого энцефалита, Осуществ:1.рня экспрессил гено структурной оболочки ВКЭ под контролен 28 к промотора вируса осповак- цины.

П .р .и м е р, Рекомбинантная плаэ- мидная ДНК р28СМЕ и способ ее конструирования.

В соответствии с известной структурой ДНК проводят химико-фермента7 тивный синтез промоторного фрагмента ДНК, при этом в целях удобства сборки промотора вводят ряд изменений в первичную структуру ДНК, Проводят синтез 2) оЛигонуклеотидов длиной 12-18 оснований, составляющих ограниченную сайтами Hindlll и EcoR i. рндонуклеаэ рестрикции последовательность промотора длиной 174 пары оснований (п.о.), Олигонуклеотиды сшивают ДНК-лигазой в несколько ду- плексой, которые затем объединяют в один длинно-протяженный фрагмент тем же ферментом. Синтетический дуплекс клонируют по Hind III и EcoRI сайтам рестрикции в плазмиде pBR 32 Полученную плазмиду обозначили р28,

Из плазмиды pUR 292, в которой клонирован Pstl-PstI фрагмент кДНК ВКЭ длиной 1900 п.о,, выделяют этот фрагмент и расщепляют его в стандар ных условиях Fok I - рестриктазой, 2 мкг Fok I - гидролизата лигируют с 0,1 мкг синтетического фрагмента ДНК (линкера), имеющего следующую структуру;

5 Ф-ААТТТСААС-ОН З ОН

/ tIMI ЗОН-АСТТССААТ -5 Ф

При этом происходит замещение Pet I Fok I фрагмента ДНК длиной 60 п,о., содержащего нетран лируемый участок

ный Pbt I-Pst 1 фрагмент к ДНК ВКЭ. Наличие в laioHax BaraHl-EcoRI фрагме та ДНК длиной 2682 п,о, определяют при помощи EcoRI и BamHI ректрик- таэ. Полученный таким образом клон был обозначен р28СМЕ, ДНК плазмиды р28СМЕ, содержащую гены всех структурных белков ВКЭ, за исключением С-концевой части белка Е, использую для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии , зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП, Уро жай вируса после трансформации высе вают на монослой перевиваемой линии клетЬк HI43 (tk). В присутствии

генома ВКЭ и AUG-кодон на EcoRI Fok 1-45 25 мкг/мл культуральной среды отби50

синтетический фрагмент ДНК, а также восстановление целостности остальной части фрагмента к ДНК ВКЭ, Этот EcoRI-Pst I фрагмент ДНК длиной 1853 п,о, сшивают с EcoRI - гидроли- зованной ДНК плазмиды р28.

Продукты сшивки расщепляют EcoRI - рестри ктазой, при этом образуется EcoRI фрагмент ДНК длиной 6292 п,о,, состоящий из плазмиды р28 длиной е. 4508 п,о. и фрагмента длиной 1784 п,о. от EcoRI - сайта к ДНК ВКЭ до EcoRI - сайта синтетического фрагмента ДНК, Выделяют EcoRI фрагмент ДНК длиной

рают tk вирусные клоны, методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах проверяют наличие нуклеотидных последовательностей ВКЭ в клонах. Клоны ВОВ, гибридизующиеся с к ДНК ВКЭ наращивают на клетках CV-t на среде ИГЛА MEM с 2Z сыворотки новорожденных телят,

В пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие антигена ЪК имму- ноферментным методом с пероксидазой хрена. Во всех исследованных образ

6292 п,п., лигируют ei o и чигяшкн г смрсыо трансформируют компр.тентные клетки Е, coli ИВ 101. Тряисформанты высевают на среду с ампициллином. В клонах, содержапрчх плазмиду р28 со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью EcoRI и Dam HI зндонуклеаз рестрикции. Из полученной таким образом плазмиды р2823, содержащей правильно состыкованные 28к промотор и структурные гены ВКЭ, выделяют BatnHI- EcoRI фрагмент ДНК длиной 2304 п.о.

Фрагмент состоит из BamHI-Hindlll фрагмента ДНК плазмиды pBR 322 длиной 346 п.о., Hindlll-EcoRI синтетического фрагмента ДНК длиной I7А п,о. и EcoRI-EcoRI фрагмента

ДНК длиной 1784 п .о., содержащего гены ВКЭ. Для окружения промотора и генов ВКЭ участками ТК-гена ВОВ выделенный BaraHl-EcoRI фрагмент лигируют с большим BairiiI EcoRI фраг- ,

ментом ДНК вектора р VAR 15 и ли- газной смесью трансформируют компё- тент.ные клетки Е. coli HB10I. Ис

комые клоны идентифицируют методом ДНК - ДНК гибридизации на Р-мече

ный Pbt I-Pst 1 фрагмент к ДНК ВКЭ. Наличие в laioHax BaraHl-EcoRI фрагмента ДНК длиной 2682 п,о, определяют при помощи EcoRI и BamHI ректрик- таэ. Полученный таким образом клон был обозначен р28СМЕ, ДНК плазмиды р28СМЕ, содержащую гены всех структурных белков ВКЭ, за исключением С-концевой части белка Е, используют для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии , зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП, Урожай вируса после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клетЬк HI43 (tk). В присутствии

25 мкг/мл культуральной среды отби0

.

рают tk вирусные клоны, методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах проверяют наличие нуклеотидных последовательностей ВКЭ в клонах. Клоны ВОВ, гибридизующиеся с к ДНК ВКЭ, наращивают на клетках CV-t на среде ИГЛА MEM с 2Z сыворотки новорожденных телят,

В пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие антигена ЪК имму- ноферментным методом с пероксидазой хрена. Во всех исследованных образ

цлх был об1гпру;;-ен антиген F5K1 н концентрации 30-1UO нг/MJi.

4

Формула няо бротеии

I , Рекомбинаитная ги1азмидная ДНК р28СМЕ, кодирующая синтез полипептидов для получения живой рекомби- I нантной вакцины протип клещевого

энцефалита, мол.м, 4,22 мегадальтон и размером 6754 п,о., содержащая

Hind II фрагмент ДНК пла МИДЫ pBR 322 размером 2326 п,о, с геном ампициллинреэистентности и участком инициации репликации;

Hind III-EcoRI фрагмент ДНК вируса осповакцины размером 767 п.о,, кодирующий N-кoнцeгvю тими- динкинаэы вируса осповакцины;

HindiI RsaI фрагмент ДИК вируса осповакцины размером 280 п.о. с 7,5к промотором;

HindJI-BamHI линкерньпл фрагмент ДНК плазмиды pUC размером 9,6 п.о.;

BamHI-Hindlll фрагмент ДНК 1гпаз- миды pBR 322 размером 346 п.о.;

HindiII-EcoRI синтетический фраг- мент ДНК с 28к промотором вируса осповакцины размером 174 п.о.;

EcoRI-Fokl синтетический фрагмент ДНК размером 9 п.о.;

Fokl-EcoRI фрагмент ДНК размером 1775 п.о., кодирующий структурные белки вируса клещевого энцефалита С, М, Е;

. EcoRmindll фрагмент ДНК вируса осповакцины, кодирующий С-концбвую часть тимидинкиназы вируса осповакцины размером 1071 п.о.;

генетические маркеры: Ыа-ген ампициллинрезистентности, определяющий устойчивость.к ампициллину при трансформации Е. coli,

tk - прерванный ген тимидИнкиназы вируса осповакцины, обуславливающий ТК -фенотип при трансформации ТК вируса осповакцины;

уиуь3

уиикя.1п,И1.1е c. iii ii. /i.nr рг(-;-г Hiiix элдонуклеап ;

EcoRI - сайт, р.сположенныГ; между С-концевой частью ГРНЛ F, т мрусл кл ,- шевого эицефалитл и npanoi частью фланга r.k-rena вируса оггк плкпины , BamHI - сайт, расположепш.и между 7,5к и 28к промоторами пир уса оспо- Q вакцины.

2, Способ конструир(1лп1М1 1 -окомби- нантной плазмидной ДПК ,, кодирующей синтеч полипептидо ..чн получения живой рекомбин.читиой накцияы , 15 протин клещевог о энцефалита, заключающийся в том, что Pst I фрагмент кДНК вируса клещевого энцефалита укорачивают Fokl - рестриктазой, соединяют посредством Fokl - licoR 20 линкера полученный фрагмент кДНК с клонированным в плазмиде pBR 322 Hind III-EcoRI синтетическим фрагментом ДНК, содержащим 28к прюмотор вируса осповакцины, образовавппвеся ре- 25 комбинантные ДНК дорезают по FiroRI- сайту, расположенному в С-коицевой части гена Е вируса клещевого энцефалита, и циклизуют при помощи ДНК-лиг газы, затем полученными рскомбинант- 30 ными молекулами ДНК трансформируют клетки E.coli НВ 101, траисформанты высевают на среду с ампициллином, из выросших клонов выделяют плачмидную ДНК, вырезают из нее BamHl-EcoRI 35 фрагмент, содержащий состыков анные с 28к промотором вируса осповакцины гена структурных белков вируса кле- щевого энцефалита, встраивают его в . ДНК вектора р VAR 15 между BamHI 40 EcoRI caйтaми для окружения указанного фрагмента участками гена тимидинкиназы вируса осповакцины, трансформируют полученными рекомбинантны- ми ДНК клетки Е, coli НВ,101, нужные 45 клоны, идентифицируют методом ДНК- ДНК гибридизации с меченным Р Pstl-PstI фрагментом кДНК вируса клещевого энцефалита и выделяют из них целевую плаэмиду р28СМЕ.

Изобретение относится к генети-j ческой инженерии и биотехнологии и может найти применение при получении живых вакцин против клсгаевого энцефалита. Рекомбинантная гигаэмидная i ДНК р28СМЕ состоит из фрагмента генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) промотора вируса осповакнины (нов) вектора, обеспечивающего встройку рекомбинантных ДНК в ДНК ВОВ. В качестве фрагмента генома ВКЭ используют фрагмент ДИК длиной 1775 п.о., кодирующий все структур- Hf-ie белки за исключением Ы концевых амитюкислот белка С и С-концевой чпс- ти белка Е а также синтетический фрагмент ДНК, 1 одирую га1й 3 и 4 аминокислоты белка С. В качестве промотора используют синтетический фрагмент ДНК ДЛИ..ОЙ 174 п.о., содержании 28к промотор. В качестве вектора дпп встройки описанных выше последовательностей в ДНК ВОВ испольгуют плат миду pVAR 15, обеспечивающую интеграцию структурных генов ВКЭ в ген тими- динкинаэы ВОВ. Рекомбинантные вирусы осповакцины, полученные на основе пере шсленных компонентов, экспрес- сируют полипоптиды, связываюгциеся с антителами против ВКЭ, при инфицировании ими клеток CV-1. 2 с.л. ф-лы. (Л 4 СО О СО У со