Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена Опейк-2 Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/48 A01H1/06 

со

ОС

Изобретение относится к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур и може быть применено при массовой оценке селекционного материала на качество белка.

Целью изобретения является упрощение способа.

Упрощение способа обеспечивается тем, что после обработки образца размолотого зерна экстрагентами и получения белковой.фракции, очистки экстракта от механических примесей в последующем анализе ген Опейк-2 выявляют по повьпиенной активности аспартатаминотрансферазы при длине волны 500-560 нм, причем обработку образца проводят при в течение 30-60 мин, а в качестве экстра- г ента используют дистиллированную воду.

Пример I. Предложенным способом приводится анализ активности АСТ-азы в зрелом зерне исходных +++А204; +++wf9; +++w64A; -t-n-wI55 и мутантных А204; , wf9;o O5O, w64A; wl55 линий кукурузы в соспоставлении с другими биохимическими критериями, характеризующими качество зерна. У всех му+антов повышенное содержание лизина и незеиновых белков, полнопенных по аминокислотному составу, коррелирует с повышенной акттивностью аспартатаминотрансферазы. Поэтому в этом примере активность АСТ-азы может являтьс критерием оценки биохимических изменений, происходящих в зерне кукуруз под действием гена Опейк-2, а следвательно, и способом выявления наличия данного гена в генотипе.

Результаты представлены в табл.

П р и м е р 2. Проводится выявление гена Опейк-2 по повьппенной активности АСТ-азы в разные фазы созрвания зерна у исходных («+-bwf9, ++-ьА204) и гомозиготных мутантных o,o,O2wf9; ,jA204 линий кукурузы. Повьпиенная активность АСТ-азы отмечается в зерне мутантов по отношению к исходным генотипам во все строки онтогенетического развития, что позволяет в отличие от известных способов вести более раннюю диагностику селекционного материала.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

начиная со стадии формирования зерна.

Результаты приведены в табл.2.

ПримерЗ. I г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в первом варианте опыта в течение 15 мин, во втором 30 мин, в третьем 60 мин., в четвертом 80 мин при 4°С. Осадок во всех вариантах опыта определяют центрифугированием. В супернатанте определяют активность аспартатаминотрансферазы.

Оптимальные пределы времени получения экстракта 30-60 мин. Снижение времени экстракции приводит к резкому падению активности аспартатаминотрансферазы, а повышение удлиняет эксперимент без получения положительного эффекта.

Результаты опытов представлены в табл.3.

Пример4. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в течение 30 мин в первом варианте опыта при 4°С, во . втором при 15°С, в третьем при 25°С. Осадок во всех вариантах опыта определяют центрифугированием, в супернатанте определяют активность АСТ- азы.

Наиболее высокий уровень энзи- матической активности наблюдался в экстракте, полученном при 4 С.

Результаты опыта приведены в табл.4.

ПримерЗ. I г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию белка в течение 60 мин, при 4°С. В пробирки вносят по 1 мл субстрата ACT и 0,2 мл кукурузного экс1 тракта. В первом варианте опыта пробы инкубируют 30 мин, во втором 60 мин, в третьем 90 мин при .

Оптимальное время инкубации пробы с субстратом 60 мин, так как в первом варианте опыта активность АСТ-азы крайне низкая, а в третьем возрастает время опыта без достиже ния дополнительного положительного эффекта.

Зависимость активности АСТ-азы от времени инкубации представлены в табл.5.

Примерб. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды, проводят экстракцию белка в течение 1 ч при А с. В пробирки вносят по I мл субстрата ACT и 0,2 мл кукурузного экстракта. После 60-минутной инкубации в пробы добавляют 1 мл I мМ 2,4-динитро- фенилгидразина и через 10 мин 10 мл 0,4 М NaOH. Через 10 мин записьшают спектр поглощения образовавшегося окрашенного комплекса в области 450-700 нм.

Обоснование граничных значений длины волны приведено в табл.6.

Приведенные в табл.6 данные свидетельствуют о том, что наиболее

значительные различия по активности аспартатаминотрансферазы между исходной и мутантной кукурузой наблю- дается при измерениях величины оптической плотности в пределах 500- 560 нм. Эти пределы являются граничными.

Формула изобретения

Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена Опейк-2, предусматривающий обработку размолотого зерна экстрагентами с получением белковой фракции, очистку от механических примесей и последующий анализ, отличаю щи й- с я тем, что, с целью упрощения

способа, ген Опейк-2 выявляют по по- выгаенной активности аспартатамин трансферазы при длине волны 500 - 560 нм. IТ а б л и ц а I

Изобретение относится к селекционно-генетическим исследованиям и может быть использовано при массовой оценке селекционного материала кукурузы на наличие гена Опейк-2 на различных стадиях созревания зерна. Целью изобретения является упрощение процесса выявления гена Опейк-2. Для этого после обработки образца размолотого зерна экстрагентами, получения белковой фракции и очистки от механических примесей при последующем анализе ген Опейк-2 выявляют по повьшенной активности аскар- татаминтрансферазы при длине волны 500-560 нм. Обработку образца проводят при температуре 0-4 С в течение 30-60 мин. 6 табл. (Л

12,4524,95

10:1217,20

23,3028,29

10,3219,90

5,428,43

5,878,17

7,9310,87

9,8511,25

лость

Молочно-восковая спелость Восковая спелость

2,510,802,1610,543,476,12

2,970,951,988,603,564,37

4,181,591,906,842,244,31

9,253,941,502,357,505,80

Таблица2

41,83

17,67 16,09

51 ,00

30,19 30,37

Линия Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности /мг белка Вариант опыта по примеру 3

...L IIL-- fL.. IllL Z

А 204 6,46 11,75 12,45 12,57 wf9 6,02 9,20 10,12 10,02

Таблица4 Линия Активность АСТ-азы, ед.опт. плотности/мг белка

Вариант опыта по примеру 4

А 20411,759,104,07

wf99,207,032,97

Таблица5

Время инкубации,мин 30 60 90

Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности/мг белка3,48 12,45 12,67

Таблицаб

Длина вол- Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности / Разность ны, нм/мг белка

+++ wf9 wf9

Таблица 3