Способ идентификации вирусов и бактерий Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

СО

с

Изобретение относится к генной инженерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот. Цель изобретения - упрощение способа. Способ индентификации вирусов и бактерий заключается в том,. что контактирование пробы осуществляют с реагентом, нанесенным на нитроцеллюлозу, и с меченным 1 реагентом. 6 табл.

со

00 05

о со

сн

Изобретение относится к генной инжейерии и касается способа идентификации вирусов и бактерий с помощью сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот.

Цель изобретения - упрощение способа.

Упрощение способа обеспечивается за счет того, что контактирование пробы осуществляют одновременно с реагентом нанесенным на нитроделлюлоJ О С

ЗУ, и с меченным I реагентом.

(

Способ подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Реагенты.

Выращивают аденовирус типа 2(АТСС VR-846 из KTL, т.е. National Publie Health Uhstitute Хальсинки), очищают и выделяют ДНК далее будет называться ) ДНК, переваривают с ВатНТ-ограничительным ферментом на четыре фрагмента. Из. этих четырех фрагментом два клонируют в BamHIcaum вектора pBR322 (ВКЬ). Затем бактериальный хозяин (E.coli НБЮГ (К12) gal, pro, leu, hrs, hrm recA, str, F (полученный из KTL) трансформируют полученной плазмидной смесью. Из числа трансформированных бактериальных клонов выбирают те, которые наиболее вероятно содержат рекомби- нантную плазмидную ДНК, а именно стойкие к ампициллину и тетрадикли- ну клоны. Однако бактерии, содержащи рекомбинантную плазмидную ДНК, чувствительны к тетрациклину, поскольку сашпВатН находится в пределах тетра циклинового гена, и введение инород- ной ДНК в эту зону разрушает геи. Клоны, содержащие плазмиды, pBR322, KTL N E231 и Ad2D-pBR322, KTL-EH230, выращивают и очищают. Рекомбинантную плазмиду Adj D-pBR322 используют в качестве фильтра-реагента. Согласно изобретения нет необходимости удалять плазмидную последовательность, поскольку данная проба не содержит последовательности pBR322. Для радиоактивного мечения нуклеиновую кислоту отделяют от pBR322-ДHK после вываривания с Bamlil посредством электрофореза агарозного ,тела. С-фрагмент выделяют из LGT-ara розы посредством экстракции фенолом или электроэлюирования и концентрируют путем осаждения этанолом.

Фиксация ДНК на фильтре.

0 5 0 0 r

0

Рекомбинантную плазмиду pBR322 денатурируют до одноцепной формы и обрабатывают 0,2 н. NaOH (5 мин, ), после чего ДНК охлаждают, перед переносом на фильтр нейтрализуют и вводят пипеткой в раствор, среда 4 SSC на льду (,t5 М NaCl,. 0,015 М цитрат натрия). Фильтры (Schleicher и Shiill ВА85 нитроцеллюлоза), тщательно смачивают в растворе 4 SSC (примерно 2 ч) до ввода ДНК. ДНК фиксируют на фильтре в разбавленном растворе (0,5-1,0 мкг/мл) путем всасывания этого раствора через фильтр при слабом вакууме. Этот фильтр способен поглощать ДНК вплоть до 180 мкг/см. Используют концентрации ДНК в пределах от 0,5 мкг ДНК/ /2,5 см диаметра фильтра до 1,0 мкг/ /ДНК/0,7 см диаметра фильтра. После фильтрации ДНК фильтры промывают в 4«SSC, высушивают при комнатной температуре и прокаливают в вакуумной печи при в течение 2 ч.

Мечение радиоактивного фрагмента нуклеиновой кислоты.

Используемым для мечения радиоактивным индикатором является изотоп

J/2 с

I . Этот изотоп детектируют с использованием - т-счетчиков, которые наиболее до ступны для лабораторных применений. Период полураспада этого изотопа составляет 60 дней, в результате чего срок использования меченых I реагентов составляет примерно 4 мес.

Мечение Путем Nick-трансляции.

В данной реакции ДНК становится радиоактивно меченой, когда раствор

содержит меченую изотопом I

/25

дезоксинуклеозидную трифосфатазу (dCTP) в качестве субстрата, в данном случае называемую 125i-d-CTP (радиоактивный центр, Амершам: -7 500 Ci/ммоль), При оптимальных условиях может быть достигнута удельная активность 10 отсч/мин/мкг ДНК. Меченую ДНК очищают от нуклеотидов, оставшихся в реакционной смеси, путем простой гель-фильтрации, например путем использования Биогеля РЗО (Биоради- активного).

Другие способы мечения.

Реагент (одноцепная нуклеиновая кислота, продуцированная MI3 тг -фа- гом) подвергают мечению путем химического иодирования, в котором актив

ный I ковалентно связан с нуклеиновой кислотой.

В случае РНК-содержащего вируса клонирование фрагментов генома осуществляют таким образом, что сначала получается воспроизводимая копия ДНК (с ДНК) вируса РНК посредством обратной транскриптазы, а затем посредством ДНК-полимеразы воспроизводится вторая цепь ДНК.

Проведение испытания.

Обработка пробы.

Микробную нуклеиновую кислоту,подвергаемую исследованиюi выделяют из самого микроба, а также из зараженных клеток, после чего ее денатурируют до одноцепной формы. Вырусные геномы высвобождают путем обработки материала пробы 1%-ным додецилсуль- фатом натрия (SDS) и разрушают белки защищающие посредством К-обработки протеиназой (1 мг/мл, 37°С, 60 мин). Кроме того, бактериальные пробы разрушают с использованием обработки лизоцимом и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЕДТА).

Если проба содержит большие количества вязкой высокомолекулярной клеточной ДНК, то с целью уменьшения вязкости этой пробы воздействуют ультразвуком или путем продавливания пробы несколько раз через тонкое отверстие.

Гибридизация.

Гибридизацию осуществляют, например, в 50%-ном формамиде (деионизи- рованный, выдержанный при - 20°С) в , раствор 1 Denhardt, содержа- 1ЦИЙ 1% SDS и 0,5 мг/мл ДНК (лососевая сперма или зобная железа теленка), при 37 С и обычно в течение ночи (16- 20 ч). Выбранные для испытания фильтры термостатируют в соответствующем сосуде, в который вводится смесь гибридизации, и начинается гибридизация Эта смесь гибридизации содержит предварительно обработанную пробу, в ко торую вводится радиоактивная нуклеиновая кислота (или кислоты) в качестве реагента, которая денатурирована совместно с этой пробой путем кипячения в течение 5 мин с последующим быстрым охлаждением при 0°С; концентрированные растворы формамида, SSC и Denhardt, которые вводят пи- петкой в денатурированную и охлажденную смесь нуклеиновых кислот. После смешивания смесь гибридизации вводят

0

5

0

5

0

5

0

пипеткой на фильтры в сосуде гибридизации. После гибридизации фильтры осторожно промывают и в отдельности подвергают замеру в j--счетчике.

Детектирование аденовируса методом сэндвич-гибридизации (табл. I).

Среду гибридизации измеряют в испытательной пробирке, содержащей лишь фильтр и меченую нуклеиновую кислоту . в качестве реагента, без пробы. Среду гибридизации создают последовательностями pBR322, находящимися в меченой нуклеиновой кислоте (реагента). Эти последовательности гибридизируют непосредственно с фильтром без участия пробы. Фильтры, содержащие зобную железу теленка и не содержащие ДНК, используют в данном испытании как контрольные, показывая, на специфичность гибридизации и на уровень неспецифической среды, создаваемой, например, при недостаточной промывке.

В табл, 1 среду, обусловленную реагентами, отделяют от срт, гибриди- зированных с фильтрами.

Меченая нуклеиновая кислота в качестве реагента.

Adj-BamHl, С - фрагмент, очищенный, удельная активность 90-10 отсч/ /мин/мкг (200000 отсч/мин I /реакция ).

Гибридизация; 50%-ный формамид, 4KSSC. РастворDenhardt, содержащий 0,5 мг/мл ДНК спермы лосося и 1% SDS, 37 С, 16 ч.

Промывка: 0,1% SSC, комнатная температура, 40 мин.

Пробы: ДНК Аденовируса типа 2

(BRL).

Заражают аденовирусом типа 2 клетки Heha. Эти клетки затем разрушают путем обработки 1% SDS с последующим .вывариванием 1 мг/мл протеиназы-К- фермента (сигма) в течение 30 мин при 37°С. Перед денатурированием пробу пропускают через тонкое отверстие. Значения, приведенные в табл. I, были рассчитаны путем выделения среды реагента, полученной при осуществлении аналогичной гибридизации, но без пробы.

Приме р 2. Детектирование РНК- вируса посредством сэндвич-гибридизации (табл. 2).

Используют модель РНК-вируса, а

именно штамм Semlike-Fores-t (прото- типный штамм, полученный в Лондонской школе гигиены и местной медицины), который является рдноцепочной РНК. Получают ДНК, которую клонируют в точку PstI- плаэмида pBR322. Ползгча- ют рекомбинантную плазмиду рКТНЗ12 KTL № ЕН232. Клон бактерий, содержащих эту плаэмиду, имеет длину, тавляющую примерно 1400 нуклеотидов со структурной белковой частью, примерно от нуклеотида 200 до нуклеоти- да 1600, когда нумерация ведется от начала структурных rerios. Для продуцирования реагентов рекомбинантнзто плазмидную ДНК рКТНЗ12 обрабатывают с ограничительным ферментом EcoRI (BRL) (последовательность, происходящая от вируса Semlike Forest, не содержит, точек распознавания для фермента EcoRI), и эту линейно вытянутую плазмиду разделяют на два фермента с использованием фермента Xhol (BRL). Точка распознавания последнего расположена внутри вирусной последовательности Semlike-Forest. Фрагмент А EcoRI-Xhal большего размера (примерно 3900 основных пар) фиксируют на фильтре, и фрагмент В меньшего размера (примерно 1850 основных

подвергают мечению изотопом с использованием метода ник

пар)

1175

трансляции. В данном испытании ис пользуют как свободный вирус SemliRe Forest, так и зараженные вирусом клетки, В обоих случаях специфические нуклеиновые кислоты вируса дан ной пробы состоят полностью из РНК.

Меченные нуклеиновые кислоты в качестве, реагентов EcoRI-XhoI - фрагмент В плазмида рКТНЗ12, удельная активность 9040 отсч/мкг ДНК (200000 отсч/мин 1 реакция).

Гибридизация. Как описано в ; табл. 1.

Промывка. Как описано в табл. I.

Пробы. До проведения испытания вирус Semlike-Forest (30 мкг) разрушают посредством SDS. Зараженные клетки подвергают обработке, как ука зано в табл. 1. Заражение вирусом Semlike-Forest осуществляют на клетках ВНК-2.

Данные, приведенные в табл. 2, рассчитывают с учетом среды реагента полученной при аналогичной гибридизации, без пробы.

П р и м е р 3. Проба вируса, в ко торой вирусный передатчик РНК детектируется посредством метода сэндвич- гибридизации (табл. 3).

- Реагенты сзндвич-гибридизации получают из ДНК вируса SV 40 (BRL) путем разделения ДНК на две части с использованием Pstl-фермента. Эти фрагменты выделяют и очищают посреди ством электрофореза на агарозном геле. Фрагмент А (4000 основных пар) подвергают радиоактивному мечению тем ник трансляции 1 и фрагмент В (1220 основных пар) фиксируют на фильтре .

Фрагменты.ДНК выбирают таким образом, что каждый содержит гены, коди г рующие как ранние, так и поздние

передатчики инфекции. Так, например, фрагмент В содержит примерно 700 основных пар от структурного белкового гена VP1 и более 600 основных пар

20 от гена более ранних передатчиков инфекции. Поскольку ДНК вируса SV 40 сама по себе представляет собой кольцо с ковалентной связь о, то она не может быть детектирована в данном

25 испытании до линейного выравнивания. Следовательно, при использовании зараженных клеток в качестве пробы можно проверить, насколько предлагаемьм способ пригоден для детектирования воспроизведенных молекул РНК вирусного генома. Как видно из результатов, приведенных в табл. 3, данное испыта- |Ние пригодно дпя исследования зараженных клеток. В табл. 3 также показано, что одни и те же реагенты используют для исследования как вирусной ДНК, так и полученной из нее m РНК (информационной РНК).

Меченая нуклеиновая кислота, используемая в качестве реагента.

Более длинный А-фрагмент Pst ДНК вируса SV 40, удельная активность 28-10 отсч/мкг ДНК (200.000 отсч/мин

лЛ 5

I реакция).

Гибридизация. Как описано в табл, 1. Продолжительность гибридизации 40 ч.

Промывка. Как оп.исано в табл. 1.

Пробы. Дпя вируса SV-40 (BRL) обрабатывают ограничительным ферментом EcoRI (BRL). Клетки С VI заражают вирусом SV 40 и собирают через 40 ч после заражения. Обработка пробы осуществляется как описано в табл. I. 55 Данные рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации, осуществляемой без пробы.

30

35

40

45

50

Приме р 4. Детектирование Bacillus amyloliquefaciens посредством сэндвич-гибридизации.

Данные реагенты представляют со- бой фрагменты с -амилазного гена В.amyloliquefaciens Е, 18, которые выделяют для данного испытания из рекомбинантной плазмиды рКТНЮ путем обработки ограничительным ферментом и последующего электрофореза агароз- ного геля. Фрагменты, используемые для данного испытания, представляют собой фрагментные участки Clal-EcoRI о -амилазного гена (460 основных пар) (Clal Boehringer Mannheim) и фрагмент EcoRI BamHI (1500 основных пар). Фрагмент EcoRI-BamHI фиксируют на фильтре, и фрагмент Clal-EcoRl подвергают радиоактивному мечению изотопом I методом ник трансляции.

Как видно из табл. 4, В.amyloliquefaciens в пробе идентифицируется путем сэндвич-гибридизации на основе одного о -амилазного гена. E.coli дает отрицательный результат в данном испытании (неотличим от среды).

Меченая нуклеиновая кислота в ка- честве реагента.

Фрагмент Clal-EcoRI с -амилазного гена от плазмиды рКТНЮ, удельная активность 35-10 отсч/мин/мкг (200000 отсч/мин I /реакция).

Гибридизация. Как описано в табл.1

Промывка. Как описано в табл. 1.

Пробы., Бактериальные пробы обрабатывают лизоцимом (67 мкг/мл) в течекие 30 мин при 37 С; в пробы E.coli вводят также 5 ммоль ЕДТА. После такой обработки во все пробы вводят SDS (до конечной концентрации 2%), затем их дважды пропускают через очень тонкое отверстие с целью сниже кия вязкости, после чего их подвергают денатурированию путем кипячения, как описано в тексте, относящемся к обработке проб.

Данные, приведенные в табл. 4,

рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при аналогичной гибридизации без пробы.

П р и м е р 5. Пример получения системы комбинаций реагента на основе метода сэндвич-гибридизации (табл. 5).

Пробы, исследуемые в данном испытании, представляют собой клетки.

0 5 0

5

о

О

5

0

5

зараженные тремя вирусами (аденовирус, вирус SV 40 и тетраплоидньй вирус Herpes, имеющий лишь один определенный детерминантньй ген) , и пробу, содержащую бактерии Bacillus amyloliquefaricus. В каждую пробу вводят одновременно следующие реагенты: пять фильтров, каждый из которых содержит один тип ДНК от вируса SV 40, аденовируса, о/-амилазного гена Bacillus amyloliquefaricus и зобной железы теленка, а также фильтр, не содержащий ДНК; кроме того, вводят 200000 отсч/мин каждого из следующих меченых нуклеиновокис- лотных реагентов: ДНК - реагент вируса SV 40, аденовируса и о -амилазно- го гена.

Данный пример показывает, что можно без разделения разбавленного раствора пробы исследовать одновременно соответствующие серии микробов путем ввода в пробу комбинации реагентов. Такая проба может содержать как вирусную, так и бактериальную нуклеиновую кислоту. Данные фильтры могут быть помечены определенным обозначением (марка, метка), которая определяет содержание в них реагентов и какой микроб фиксирован (гибридизи- рован) с ними. Эта метка может быть представлена в виде цифр или букв, например 1 или SV 40 2 или Ad и т.д., или могут быть приняты другие обозначения, например -f для SV 40 или 3 для AD или О для Bacillus.

Меченые нуклеинокислотные реагенты. Вирус SV 40 как и в табл. 3. Аденовирус как и в табл. 1 . о -амилазный ген как и в табл. 4.

. Гибридизация. Как в табл.1.

Промывка. Как в табл I.

Пробы. Клеточные пробы, зараженные вирусом SV 40 и аденовирусом, были описаны соответственно в табл.3 и 1.

Клетки Vero 10 заражают вирусом Herpes (тетраплоидом, имеющим лишь один определенный детерминантньй ген) типа 1. Клетки собирают через 20 ч после заражения, поскольку может иметь место фагоцитарньм эффект. Пробу обрабатывают таким же образом, как описано для клеток, зараженных аденовирусом (табл. I),

20

91386031

Проба Bacillus amyloliquefaciens. Как в табл, 4.

Данные, приведенные в табл, 5, рассчитаны с учетом среды реагента, полученной при осуществлении аналогичной гибридизации без пробы.

П р и м е р 6. Детектирование Escherichia coli путем сэндвич-гибридизации (табл. 6).to

Реагенты получают из отр-А-гена (А - ген наружного мембранного белка) Escherichia coli,

Гибридные плазмиды рКТНАО и рКТН45, используемые в качестве исходного материала, приготавливают из плазмиды pTUlOO.

Плазмиду рКТН45 (находящуюся на хранении как KTL, в институте Natio- nal Public Health Хельсинки, под номером ЕМ254),. используемую в качестве фильтра-реагента, состоит из 740 основных пар от 5 -концевого звена гена отрА, введенного в плазмид PBR322,

Плазмида рКТН40 содержит 300 основных пар от З -концевого звена гена отрА, после чего следует 1400 основных пар от генома E.coli, Плазмиду рКТН40 расщепляют ограничительным ферментом BamHI до получения фрагмента ДНК E,coii, который содержит 1700 основных пар, как указано выше. Этот фрагмент переносят в одноцепной бактериофаг М13тр7. Рекомбинантный фаг КТН1207 (обозначаемьй как KTJj № ЕН256) подвергают мечению изотопом I и используют в качестве инди- катора в способе сзндвич-гибридизации.

ДНК от разрушенных клеток E.coli, а также выделенная и очищенная ДНК от клеток E.coli детектируют посредством сэндвич-гибридизации, как покапр

ну пр

от по за

5 Ф

25

30

35

40

ги вк ти с н м т а т к о н п э в т ч т

зано в табл. 6.

Меченые нуклеинокислотные реагенты m KTHI207, удельная активность 8-10 отсч/мин/мкг ДНК (200000 отсч/ /мин/реакция).

Гибридизация. раствор IxDen- hardt без BSA (альбумин бычьей сыворотки, 0,25% SDS 200 мкг/мл ДНК спермы Herring 17,5 ч 65 С,

Промывка. Как описано в табл. 1.

Пробы. ДНК клеток E.coli К 12 НВ101 выделяют, ДНК денатурируют

10

при концентрации 7 ммоль NaOH, при 100°С, 5 мин.

Клетки обрабатывают лизоцимом (500 мкг/мл), ЕДТА (70 ммоль, 37°С, 30 мин), SDS (0,25%, 65°С) и свободную ДНК денатурируют путем кипячения при концентрации NaOH 14 ммоль, при 100°С, 5 мин.

Данные, представленные в табл, 6, откорректированы на среду реагента, полученную при аналогичной гибридизации, без пробы.

Формула изобретения

Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич- гибридизации нуклеиновых кислот, включающий последовательное контактирование пробы нуклеиновой кислоты с нуклеиново-кислотным реагентом, нанесенным на твердьй носитель, и меченым нуклеиново-кислотным реагентом, с последующим радиоактивным, анализом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, контактирование пробы осуществляют одновременно с реагентом, нанесенным на твердый носитель, с последующей промывкой полученного гибрида, при этом для идентификации аденовирусов в качестве реагента, нанесенного на твердьй носитель, используют pBR322 размером 47000 п.р., а в качестве меченого реагента-фрагмент Adj BamHI размером 6200 п.о., для идентификации вируса Semiike-Forest - фрагмент EcoRI-XKoI размером 3900 п.о плазмиды рКТН312 и фрагмент EcoRI- Xhol плазмидь: рКТН312 размером 1850 п.о., для идентификаций вируса SV 40-PstI - фрагмент вируса SV 4,0 размером 1220 п.о. , для идентифика- ции бактерий Bacillus amyloliquefaciens - фрагменты EcoRI-BamHI пЛазми- дь1 рКТНЮ размером 1500 п.о. и Clal- EcoRI плазмиды pKTHlO размером 4600 п.6., для идентификации Escherichia coli - плазмиду рКЗ Н45 размером 740 п.о. и рекомбинантный фаг тКТН1207 размером 1700 п.о., для одновременной идентификации аденовирусов, SV 40, SimliKe-Forest, Bi amyloliquefaciens и E.coli используют все описанные выше реагенты одновременно.

Т а б л и ц а 1 Испытание с аденовирусом

2-ДНК аденовирусного

типа (BRL)

(500 нг)

НеЬа-клет- ки (6-10), зараженные аденовирусом

- pBR322 плазмиды, 2 мкг. ДНК зобной железы теленка, 1 мкг (Boehvinger Manheim). Холостое испытание (отсутствие ДНК).

Таблица

Детектирование вируса Semlike-Fo- rest посредством метода сэндвич- гибридизации

Вирус Sem- like-Fo- rest 30 мкг

Клетки,

зараженные

вирусом

Semiike- Forest (5-10)

Незараженные клетки

Фрагмент А EcoRI-XhoI (1,2 мкг)

плазмиды pKTH3i2.

ДНК зобной железы теленка, 1 мкг. Холостое испытание (отсутствие

ДНК).

, 9000

49

8200

3340

33

2698

10

10

8

Таблица 3

Детектирование вируса SV 40 посредством сэндвич-гибридизации

1

20061

159

104

(0,2 мкг) ДНК кольцевого вируса; SV-40, вываренный с Pstl - ограничительным ферментомлп ДНК зобной железы теленка, 1 мкг.

Холостое испытание (отсутствие ДНК)

Таблица4 Бактериальная диагностика посредством сэндвич-гибридизации

ДНК плаз- ми ды рКТНЮ (вытянутая в линию) I мкг

5773

47

Без пробы EcoRl-BamHI фрагмент о -амилаз- ного гена из плазмиды РКТНЮ, мкг. .ДНК зобной железы теленка, 1 мкг.

vff tef.

Холостое испытание (без ДНК).

Клетки, зараженные вирусом SV 40

(юМ

Клетки, зараженные аденовирусом типа 2 (6-ГО)

Клетки, зараженные вирусом Herpes (тетраплоидом)

(юМ

Bacillus amy- loliquefасiens

Незараженные клетки

Как описано в табл. 3.

Как и в табл. 1 . Как и в табл. 4.

ДНК зобной железы теленка, 1 мкг. . Холостое испытание (отсутствие ДНК).

Табли Детектирование путем сэндвич-гибридизации

ДНК от E.CDli К 12 НВ101 а) 2-10

ДНК от E.coli К 12 НВ101 а) 2 -10

ТаблицаЗ

13

22

31

8750

13

13

6500

16

282

2206

Клетки E.coli К12НВ101 б) 2-10

Клетки E.celi KI2HB101 б) 2 -108

а)Ряд молекул ДНК

б)Ряд клеток

11лазмида рКТН45, 1,088 мкг (2 молекул), ДНК зобной железы теленка, 1,088 мкг.

Холостое испытание (отсутствие ДНК)

II 13

2327

12